Gas hidrogen (H2) merupakan bahan bakar alternatif yang dapat diproduksi oleh mikroorganisme melalui fermentasi memanfaatkan limbah organik. Penelitian bertujuan mengetahui produksi H2 menggunakan kultur campuran mikroorganisme dengan substrat limbah biodiesel. Penelitian dilakukan di Laboratorium Teknologi Bioindustri BPPT Serpong selama lima bulan (Maret--Juli 2006). Produksi H2 dalam limbah biodiesel dilakukan secara fermentasi gelap pada 37o C selama 72 jam oleh kultur campuran Bacillus megaterium MS 961, Bacillus stearothermophilus DSM 22, dan Enterobacter aerogenes AY-2 serta kultur tunggal E. aerogenes AY-2 sebagai kontrol. Penggunaan kultur campuran pada substrat gliserol murni menghasilkan H2 (2,24 mol H2/mol gliserol) dan etanol lebih banyak dibandingkan kultur tunggal (1,93 mol H2/mol gliserol), sedangkan produksi asam laktat dan 2,3-butandiol lebih sedikit. Penggunaan kultur campuran pada substrat limbah biodiesel menghasilkan H2 (1,8251 mol H2/mol gliserol), akan tetapi hasil tersebut lebih sedikit dibandingkan kultur tunggal (1,8619 mol H2/mol gliserol). Pengukuran metabolit lain menunjukkan kultur campuran memproduksi etanol lebih sedikit tetapi memproduksi asam laktat dan 2,3-butandiol lebih banyak dibandingkan kultur tunggal. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa H2 dapat diproduksi menggunakan kultur campuran dengan substrat limbah biodiesel, walaupun produksi H2 tersebut lebih kecil dibandingkan kultur tunggal.