Salah satu upaya pemerintah dalam menanggulangi HIV/AIDS adalah dengan dilaksanakannya program screening HIV pada kelompok risiko tinggi. Pekerja Seks Komersial (PSK) sebagai salah satu kelompok risiko tinggi merupakan salah satu target untuk melakukan screening HIV/AIDS. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan antara tingkat pengetahuan tentang HIV/AIDS dengan motivasi eks PSK untuk meiakukan screening HIV yang nantinya akan dapat membantu menerapkan metode pendekatan terhadap kelompok risiko tinggi dalam meningkatkan kewaspadaan terhadap penularan HIV melalui screening HIV ini.Penelitian ini menggunakan desain konelasi dengan jumlah sampel 39 orang eks PSI( yang berada di Panti Sosial Karya Wanita, Pasar Rebo Jakarta Timur yang dipemleh dengan metode quota sampling. Analisis data dilakukan dengan menggunakan uji chi square dengan tingkat kemaknaan 0,05.Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada hubungan bermakna antara tingkat pengetahuan tentang HIV/AIDS dengan motivasi eks PSK untuk melakukan screening HIV (p=0,006). Hasil penelitian ini dapat digunakan referensi awal bagi pentingnya pelaksanaan program screening HW untuk kelompok risiko tinggi khususnya PSK dengan dasar pemberian motivasi melalui penyuluhan- penyuluhan kesehatan.