Penggunaan antibodi poliklonal dalam sis tern pondeteksi antigen P24 HIV- 1 layak untuk dipertimbangkan mengingat variasi susunan epitop P24 pada berbagai subtipe HIV -I berpotensi mengaldbatksn kegagalan pengenalan epitop oleh antibndi monoklonal. Antibodi poliklonal yang dipero!eh melalui induksi dengan antigen rekombinan berpotensi bereaksi seeara non spesifik terhadap protein kontaminan yang terdapat dalam sediaan antigen rekombinan sehingga dapat berpengaruh pada spesifisitas sistem pendeteksi antigen.
Pada penelitian sebelumnya diperoleh informasi mengenai reaksi non spesifik serum anti P24 HIV -I poliklonal yang dihasilkan melalui imunisasi kelinci, khnsusnya terhadap antigen E.coli dan Bovine Serum Albumin (BSA). Oleh ksrena penelitian ini, maka diteliti efek purifikssi dengan kromatografi afinitas dalam menghilangkan reaktivitas non spesifik antara serum anti P24 dengan E.coli dan BSA. Dampak ini dinilai dengan menggunakan teknik sandwich Enzyme Linked Immunoassay (ELISA).
Purifikasi dilaknkan dengan menggunakan dua kolom kromatografi afinitas dengan ligan E.coli pada kolom pertama dan ligan P24 rekombinan HIV-1 pada kolom kedua CnBr -.sepharose digunakan sebagai matriks. Proses elusi menggunakan glycine HCI, pH 2,7. Eluen basil purifikasi dikonfirmasi dengan teknik SDS PAGE, western blot dan sandwich ELISA pendeteksi antigen P24 HIV -I. Pada SDS PAGE terbentuk pita an tara berat molekul 45-116 kDa yang menunjukkan pita antibodi. Pada uji western blot terdapat pita spesifik protein P24 rekombinan H!V -! dan tidak muncul pita non spesiflk terhadnp E.ooli. Sedangkan pada uji sandwich ELISA, eluen menunjukkan nilai abwrbansi yang lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif, dan terdapat penurunan nilai absorbansi dibandingkan dengan sistem laripa antibodi yang dipurifikasi. Nilai absorbansi cluen juga tidak menunjukkan hasil yang berbeda dengan kontrol negatif jika direaksikan dengan antigen E.coli. Namun reaktifitas non spesiflk e]uen dengan BSA pacta sistem sandwich ELISA tidak berbeda dengan reaktifitas serum prepuriflkasi. Pada uji western blot dan sandwich ELISA diperoleh pula informasi yang menunjukkan adanya reaksi non spesifik antara antibedi anti-kelinci yang digunakan dengan protein E.eo!L
Puriflkasi antibedi dengan menggunakan metode kromatografi afmitas telah berhasil dilaknkan dengan kondisi optimal pemurnian dan telah diperoleh eluen yang mengandung antibodi terhadap P24 rekombinan HIV -1 yang tidak bereaksi dengan protein E.coli Reagensia yang digunakan dalam sistem pendeteksi berpotensi menimbulkan ikatan non spesiflk yang dapat mengganggu nilai absorbansi sehingga sebelum digunakan harus dinilai kelayakannya untuk digunakan dalam sistem diagnostik tertentu.
Polyclonal antibody may be important to be considered in sandwich ELISA which detected HIV-1 P24 due tO the existing variations in P24 epitope structure. Variations in epitope structure has the potential to produce false negative result in serologic diagnostic system that utilize monoclonal antibody. Polyclonal antibody induced by recombinant antigen could exhibit non specific reaction due to the presence of coniaminanl in antigen preparation that originates from the host used for expression of the recombinant antigen.
In the previous research, we have already known that our polycional antibody in P24 H!V recombinant immunized rabbit serum had non specific reaction with E. coli protein and Bovine Serum Albumin (BSA) in sandwich ELISA system for detecting HIV-1 P24 recombinant protein. This was the ma}or reason to purifY the antibody with affinity chromatography. Our goal war to reduce the non specific reaction. We used sandwich Enzyme Linked Immunoassay (ELISA) to see the effect of purification.
We used two columns affinity chromatography with different ligand in each column and CnBr sepharose as solid support. The first column utilized E.coli protein as ligand and the second one used HIV-1 P24 recombinant protein. We used glycine HCI, pH 2, 7 to elute antibody from qfflnity chromatography column. Eluen from the second column was coNfirmed with SDS PAGE, western blot and sandwich ELISA. SDS PAGE followed by comassie blue staining showed specific bands between 45-116 kDa molecular weight, which were interpreted as heavy and light chain fragments of antibody. Purified antibody in the second eluen was shown to be reactive with HIV-1 P24 recombinant protein but not E. coli protein by western blot analysis. There was a decline in the absorbance when eluen was used as detection antibody in sandwich ELISA system, compared with the system that utilized pre purified antibody. We also observed there was non specific reaction between the components in sandwich ELISA for detection of H/V-1 P24 recombinant antigen, in that we found the antibody against anti- rabbit JgG which was used in sandwich ELISA system had non specific reaction with E,cali protein.
We concluded that we gained optimal condition in polyclonal antibody purification to reduce non specific reaction between polyclonal antibody to HW-1 P24 recombinant antigen with E.coli protein. Reagents which used in our sandwich ELISA system potentially Caused non specific reaction so we have to consider their application.
