Siklofosfamid merupakan agen kemoterapi kanker yang memerlukan bioaktivasi oleh sitokrom P450 menjadi metabolit aktifnya yaitu 4-hidroksisiklofosfamid untuk menghasilkan efek sitotoksik. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh metode yang optimum dan tervalidasi dalam menganalisis siklofosfamid dan 4- hidroksisiklofosfamid secara simultan dalam plasma menggunakan metode kromatografi cair kinerja ultra tinggi tandem spektrometri massa. Pemisahan dilakukan dengan kolom Waters Aqcuity UPLC Class BEH C18 1,7 μm (2,1 x 100 mm) yang dilindungi prekolom VanGuardTM BEH 1,7 μm dengan fase gerak berupa asam format 0,1% - metanol dengan gradien elusi dan laju alir 0,2 mL/menit. Deteksi massa dilakukan dengan Waters Xevo TQD tipe Electrospray Ionization (ESI) positif pada mode Multiple Reaction Monitoring. Siklofosfamid dideteksi pada m/z 260,968 > 139,978; 4-hidroksisiklofosfamid-semikarbazida pada 338,011 > 224,979; dan parasetamol sebagai baku dalam pada 152,040 > 109,779. Senyawa 4-hidroksisiklofosfamid sangat tidak stabil dalam plasma dan karenanya diperlukan proses derivatisasi terlebih dulu. Derivatisasi dilakukan dengan semikarbazida-hidroklorida 2 M dalam dapar kalium fosfat 50 mM pH 7,4. Sampel plasma sebanyak 250 μL yang telah diderivatisasi diekstraksi menggunakan 1 mL etil asetat, dilakukan pencampuran putar, dan sentrifugasi pada 3.000 rpm selama 10 menit. Metode ini linear pada rentang 50 ? 10.000 ng/mL dengan r ≥ 0,9999 untuk siklofosfamid dan 5 ? 500 ng/mL dengan r ≥ 0,9994 untuk 4-hidroksisiklofosfamid. Nilai % diff dan koefisien variasi (KV) untuk akurasi dan presisi intra hari dan antar hari selama tiga hari tidak lebih dari 15% dan tidak lebih dari 20% pada konsentrasi LLOQ. Secara keseluruhan, metode ini memenuhi persyaratan selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, carry over, dan efek matriks sesuai EMEA Guidelines.

---

Cyclophosphamide is an agent for cancer chemotherapy that requires bioactivation by cytochrome P450 to its active metabolite, 4-hydroxycyclophosphamide, to manifest its cytotoxic activity. The aim of this reasearch is to develop an optimum and validated method on analyzing cyclophosphamide and 4-hydroxycyclophosphamide simultaneously using ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chromatographic separation was achieved by a Waters Acquity UPLC Class BEH C18 column (1.7 μm, 50 mm x 2.1 mm) protected by a VanGuardTM BEH 1.7 μm precolumn. The mobile phase consisted of formic acid 0.1% and methanol under gradient elution and flow rate of 0.2 mL/min. Mass detection was performed on Waters Xevo TQD equipped with an electrospray ionization (ESI) source at positive ion mode in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Cyclophosphamide was detected at m/z 260.968 > 139.978, 4-hydroxycyclophosphamide-semicarbazide at m/z 338.011 > 224.979, and paracetamol as internal standard at m/z 152.040 > 109.779. Due to the highly instability of 4-hydroxycyclophosphamide in plasma, it is necessary to undergo derivatization process. Derivatization was performed by 2 M semicarbazide hydrochloride that was diluted with 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.4. Plasma was extracted using 1 mL ethyl acetate, followed by whirl-mixing for 2 minutes, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. This method fulfill the acceptance criteria of linearity in range of 50 ? 10.000 ng/mL with r ≥ 0.9999 for cyclophosphamide and 5 ? 500 ng/mL with r ≥ 0.9994 for 4-hydroxycyclophosphamide. This method also fulfill the acceptance criteria for accuracy and precision within and between run in three days by % diff and coefficient of variation (CV) not more than 15% and not more than 20% for LLOQ concentration. Overall, this method fulfill the acceptance criteria for selectivity, linearity, accuracy, precision, carry over, and matrix effect based on EMEA Guidelines.