ABSTRAKGlioblastoma multiforme adalah tumor otak ganas yang bersifat agresif dan invasif dengan tingkat kekambuhan yang tinggi. Pada lingkungan mikro tumor ditemukan berbagai sitokin dan kemokin yang disekresikan sel stroma yang memiliki peranan terhadap pertumbuhan, proliferasi sel, ketahanan hidup sel maupun apoptosis sel. Salah satu sitokin proinflamasi yang ditemukan pada conditioned medium sel punca tali pusat adalah TNF-a. Penelitian sebelumya pada sel glioblastoma multiforme yang diberikan conditioned medium sel punca tali pusat menunjukkan peningkatan ketahanan hidup sel, namun belum diketahui bagaimana pengaruh pensinyalan TNF-α pada ketahanan hidup sel tersebut. Dengan demikian tujuan penelitian ini untuk medeteksi TNF-a pada conditioned medium sel punca tali pusat dan menganalisis dampak pemberian conditioned medium terhadap ekspresi dan persinyalan TNF-a yang mempengaruhi ketahanan hidup sel glioblastoma multiforme.
METODE: Dilakukan kultur sel glioblastoma T98G dengan DMEM komplit hingga subkonfluen. Kemudian sel punca tali pusat dikultur dengan medium aMEM komplit hingga subkonfluen. Setelah subkonfluen medium sel punca tali pusat diganti dengan medium aMEM tanpa serum untuk membuat conditioned medium (CM) dan diinkubasi selama 24 jam. Level TNF-a dianalisis dengan tehnik ELISA pada conditioned medium tersebut. CM dibuat dengan konsentrasi 50% (v/v) yang diberikan pada sel glioblstoma T98G. Setelah 24 jam, sel T98G diekstraksi untuk isolasi RNA dan protein. RNA total diperoleh dengan menggunakan reagen TriPure dan ekspresi mRNA TNFR1, TNFR2, TRAF2, dan NFκB dianalisis dengan qRT-PCR menggunakan reagen Sensifast SYBR NO ROX kit. Analisis ekspresi relatif menggunakan rumus Livak. Penghitungan kadar protein TNFR2 menggunakan metode sandwich ELISA. Ketahanan hidup sel yang dianalisis dengan menggunakan Trypan Blue. Analisa statistik menggunakan uji t independen dengan software SPSS 23.
HASIL: TNF-α terdeteksi pada conditioned medium sebesar 4,4 pg/ml. Ekspresi relatif mRNA TNFR1 meningkat 1,4 kali (p=0,038), ekspresi realtif mRNA TNFR2 meningkat 4,9 kali (p=0,001), ekspresi relatif mRNA TRAF2 meningkat 5,5 kali (p=0,00), dan ekspresi relatif mRNA NFκB meningkat 1,8 kali (p=0,001) dari kontrol. Konsentrasi TNFR2 pada sel T98G yang diinduksi CM (11,2 pg/mg protein) meningkat 1,4 kali dibandingkan kontrol (7,7 pg/mg protein). Terdapat peningkatan proliferasi sel glioblastoma multiforme 1,7 kali pada sel T98G dengan pemberian CM dibandingkan dengan kontrol (p=0,002).
KESIMPULAN: Conditioned medium sel punca tali pusat meningkatkan ekspresi pensinyalan TNF-α yang mempengaruhi ketahanan hidup sel GBM T98G.
ABSTRACT Glioblastoma multiforme is a malignant primry brain tumor
which is aggressive and invasive. Tumor microenvironment contained cytokines
and chemokines produced by MSCs stomal cells, could affect cell growth,
proliferation, cell survival and apoptosis. One of the proinflammatory cytokines
found in CM UCSCs is TNF a. On previous studies glioblastoma multiforme cells
treated conditioned medium umbilical cord mesenchymal stem cell showed higher
cell survival, but it was not known yet how the TNF a signaling affected these
proliferations. Thus the purpose of this study was to detect TNF-a in the conditioned
medium umbilical cord mesenchymal stem cell and to analyze the impact of the
conditioned medium on the expression and cell survival of glioblastoma multiforme
cells through TNF-α signaling.
METHODS: Gliolblastoma multiforme T98G cells were cultured with complete
DMEM high glucose until subconfluence. Then umbilical cord derived
mesenchymal stem cells (UCSCs) were cultured on the αMEM medium complete
with serum until subconfluence. Then UCSCs medium is replaced with the αMEM
medium to make conditioned medium for 24 hours. TNF α was detected in CM
UCSC by ELISA. CM UCSCs concentration is 50% (v/v) to treat T98G cells. After
24 hours, T98G cells was extracted for RNA and protein. RNA samples were
extracted using TriPure reagents and mRNA expressions TNFR1, TNFR2, TRAF2,
and NFκB were calculated by qRT PCR with SYBR NO ROX kit. Analysis of relative
expressions mRNA using the Livak formula. Protein levels TNFR2 was measured
using sandwich ELISA. Cell survival was analyzed by Trypan Blue Exclucion Test.
Statistics analysis using student t test and PASW 23.
RESULT: TNF-α level detected in CM-UCSCs was 4,4 pg/ml. The relative
expression of mRNA TNFR1 higher 1.4 fold (p=0.038), mRNA TNFR2 higher 4.9
fold (p = 0.001), mRNA TRAF2 higher 5.5 fold (p=0,000), and mRNA NFκB higher
1.8 fold (p=0,001) to control. Protein TNFR2 in CM treated cells (11.5 pg/mg
protein) was higher 1.4 fold to control (7.7 pg/mg protein). There was increase of
proliferation T98G cells higher 1,7 fold to control (p = 0.002).
CONCLUSION: Conditioned medium umbilical cord derived mesenchymal stem
cells (CM UCSCs) have increased the expression of TNF-α signaling for T98G
glioblastoma multiforme cell survival.
T-Pdf Yohana.pdf :: Unduh