Latar belakang: Difteri merupakan penyakit infeksi bakteri yang diperantarai olehtoksin. Corynebacterium diphtheriae adalah penyebab tersering difteri. Diagnostiklaboratorium harus dilakukan dengan cepat untuk menunjang diagnosis klinis difteri.Pemeriksaan mikroskopik tidak direkomendasikan karena tidak spesifik, kultur dan ujitoksin yang merupakan uji baku emas cukup memakan waktu, membutuhkanketerampilan dan pengalaman serta hanya dilakukan di laboratorium rujukan. PCRmerupakan metode pemeriksaan yang cepat, sensitif dan spesifik. Duplex real-time PCRdapat mendeteksi bakteri penyebab tersering dan gen pengkode toksin secara simultan.Tujuan penelitian: Melakukan optimasi uji duplex real time PCR untuk deteksi C.diphtheriae potensial toksigenik dan menerapkannya pada spesimen usap tenggorokpasien tersangka difteri.Metode: Duplex real-time PCR menggunakan dua pasang primer dan probe dengantarget gen rpoB C.diphtheriae dan toksin difteri subunit A Tox. Parameter yangdioptimasi adalah suhu penempelan, konsentrasi masing-masing primer dan probe,inhibitor, reaksi silang dengan patogen lain dan ambang batas deteksi uji. Kemudian ujidiaplikasikan pada spesimen usap tenggorok pasien tersangka difteri yang dirawat diRSPI Sulianti Saroso pada periode 2018-2019. Sebagai perbandingan dilakukan uji Elekuntuk konfirmasi toksigenitas dan analisa data klinis pasien.Hasil: Kondisi optimal uji didapat pada suhu penempelan 55oC, konsentrasi primer Cd0,4 μM, primer Tox 0,6 μM, probe Cd 0,5 μM dan probe Tox 0,625 μM, volume elusiekstraksi DNA 50 μL, volume cetakan DNA 5 μL dan ambang batas deteksi 2 CFU/ml.Uji tidak bereaksi silang dengan mikroorganisme lain yang dicobakan. Dari 89 sampel,proporsi positif C.diphtheriae potensial toksigenik dengan uji duplex real-time PCRadalah 21,3%, sedangkan proporsi positif C.diphtheriae toksigenik menggunakan ujibaku emas adalah 11,2%.Kesimpulan: Duplex real time PCR untuk deteksi C.diphtheriae potensial toksigeniktelah dioptimasi dan diaplikasikan pada pasien tersangka difteri. Diharapkan uji inidapat meningkatkan diagnosis laboratorium kasus difteri.

---

Background: Diphtheria is toxin-mediated bacterial infection. The most common

etiology is Corynebacterium diphtheriae. Laboratory diagnostic should be done

immediately to support clinical diagnosis. Microscopic examination is not

recommended, culture followed by toxin test is consider gold standard but timeconsuming,

require experience and only done in referral laboratory. PCR is fast,

sensitive and specific. Duplex real-time PCR can detect bacteria and toxin-encoding

gene simultaneously.

Objective: Optimizing duplex real-time PCR assay for detection of potentially

toxigenic C.diphtheriae and applicate the assay on throat swab of suspected diphtheria

patient.

Method: Two pair of primers and specific probe targeting rpoB gene of C.diphtheriae

and A-subunit of diphtheria toxin gene were used in this study. Parameters including

annealling temperature, concentration of primers and probes, inhibitors, cross reaction

and detection limit were being optimized to receive optimal condition. The optimized

assay was applicated on throat swab of suspected diphtheria patient in Sulianti Saroso

Infectious Disease Hospital at 2018-2019. Elek toxigenity test was used for comparison

and clinical data of the patient were analyzed.

Result: The optimum condition for duplex real-time PCR was received upon the

annealing temperature 60oC, concentration of Cd primer 0,4 μM, Tox primer 0,6 μM,

Cd probe 0,5 μM, Tox probe 0,625 μM, DNA elution volume 50 μL, DNA template

volume 5 μL and detection limit 2 CFU/ml. There was no cross reaction found with

other tested microorganisms. Of 89 samples, proportion of potentially toxigenic

C.diphtheriae was 21,3% and proportion of toxigenic C.diphtheriae confirmed by gold

standard was 11,2%.

Conclusion: Duplex real time PCR has been optimized for detection of potentially

toxigenic C.diphtheriae. This method can be used to detect C.diphtheriae and Tox

simultaneosly and increase supporting diagnosis.