Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"ABSTRAKProtein Voltage dependent anion channel 3 (VDAC3) merupakan salah satu kandidat antigen untuk pengembangan metode imunokontrasepsi pada pria. Penelitian bertujuan membuat konstruksi vektor rekombinan gen VDAC3 pada vektor pET100/D-TOPO melalui metode directional TOPO® cloning. Fragmen gen VDAC3 target berukuran 600 bp diamplifikasi dari cDNA yang berasal dari mRNA sel sperma manusia dengan primer spesifik gen VDAC3 ekson 6--10. Gen VDAC3 target disisipi sekuens CACC pada ujung 5? untuk ligasi pada vector menggunakan topoisomerase I. Vektor rekombinan hasil transformasi dengan metode kejutan panas pada sel E. coli TOP10 diseleksi menggunakan medium ampisilin. Analisis transforman dengan PCR colony menggunakan primer gen VDAC3 rekombinan menghasilkan pita DNA berukuran 607 bp. Hasil penelitian menunjukkan gen VDAC3 telah berhasil dikonstruksi ke dalam plasmid pET100/D-TOPO.

---

ABSTRACTVoltage-dependent anion channel 3 (VDAC3) protein is one of antigen candidate for the development of methods immunecontraception in males. The research aims to create a recombinant gene vector construction of VDAC3 gene on pET100/D-TOPO vector via directional TOPO® cloning method. VDAC3 target gene fragment size 600 bp was amplified from cDNA derived from mRNA of human sperm cells with the gene specific primers VDAC3 exons 6--10. VDAC3 target gene inserted at the end of the 5? CACC sequence for ligation to the vector using topoisomerase I. Recombinant vector which is transformed by heat shock on the cell E. coli TOP10 selected using ampicillin medium. Analysis of transformants by colony PCR using the primers VDAC3 recombinant gene produced 607 bp DNA band size. The results of the study showed VDAC3 gene has been successfully constructed into the plasmid pET100/D-TOPO."

"ABSTRAKKeberhasilan suatu transformasi dalam kloning molekular untuk mengetahui apakah suatu gen telah tersisipi atau terekspresi dalam populasi sel atau organisme dapat diketahui melalui gen pelapor. Salah satu gen pelapor adalah sgfpS65T yang menyandi kemampuan menghasilkan warna/perpendaran cahaya lebih baik dengan bantuan sinar biru di antara varian gfp lainnya dan efisien karena tidak membutuhkan substrat untuk mengetahui ekspresinya, sehingga tidak bersifat toksik dan mempercepat proses seleksi transforman. Vektor kloning yang akan digunakan untuk membawa gen sgfpS65T ini adalah vektor binary pCAMBIA1305.1 yaitu vektor pembawa gen gusPlus sebagai gen pelapornya dan vektor yang umum digunakan untuk transformasi ke tanaman. Karena untuk mengetahui ekspresi dari gen gusPlus membutuhkan substrat yang dapat bersifat toksik terhadap sel transforman, maka dilakukan substitusi gen pelapor gusPlus pada pCAMBIA1305.1 dengan sgfpS65T dari pNU400 melalui konstruksi plasmid. Dari hasil penelitian ini diperoleh konstruksi plasmid pCAMBIA1305.1 pembawa fragmen sgfpS65T (pDWJ3) dengan panjang 720 bp, namun pada fragmen tersebut terdapat mutasi (substitusi basa) pada posisi 294 bp dan 710 bp. Pada posisi 294 bp menyandi asam amino yang sama dengan sequence acuan yaitu threonine dan pada posisi 710 bp menyandi asam amino yang berbeda yaitu phenylalanin, yang seharusnya menyandi asam amino leusin. Jadi, kemungkinan pDWJ3 tidak dapat mengekspresikan gen sgfpS65T dan diperlukan analisis lebih lanjut dan memastikan kembali mutasi yang terjadi pada fragmen tersebut.

---

ABSTRACTThe success of a clone transformation can be identified by reporter gene. This gene can detect whether a particular gene has been inserted and expressed in cells or organisms, one of which is sgfpS65T that encode the ability to produce color better than other gfp variants and efficient because it does not require a substrate to determine the expression, non toxic and accelerate the selection process transformant. pCAMBIA1305.1 is cloning vectors that will be used to carry sgfpS65T. pCAMBIA1305.1 binary vector carrying reporter gene gusPlus and commonly used for plant transformation. Due to determine the expression of gusPlus requires a substrate that can be toxic to the cell transformant, then performed reporter gene substitution gusPlus contained in pCAMBIA1305.1 with sgfpS65T from pNU400 through the construction of plasmid. This study has obtained pCAMBIA1305.1 containing 720 bp sgfpS65T (pDWJ3), but these fragments contained mutation (base substitution) at position 294 bp and 710 bp. At position 294 bp encode the same amino acid sequence of reference threonine, at position 710 bp encode a different amino acid that is phenylalanin, which should encode the amino acid leucine. Thus, the possibility can not express sgfpS65T (pDWJ3) and required further analysis and ensure that mutations occur in these fragments."

"Bakteriosin merupakan senyawa peptida yang dihasilkan bakteri asam laktat yang berguna untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain dengan tingkat kekerabatan yang dekat. Bakteriosin 2 (bac2) dari W. confusa MBF8-1 dapat diamplifikasi dengan metode PCR dan dikloning dengan menggunakan sistem rekombinasi Gateway®. Sistem Gateway® memanfaatkan sistem rekombinasi spesifik bakteriofage lambda sehingga tidak diperlukan enzim restriksi dan ligasi. Metode Gateway® terdiri dari dua tahap, yaitu tahap pertama menggunakan primer spesifik gen bac2 yang ditambahkan penyangga dan tahap kedua menggunakan primer adapter yang juga ditambahkan penyangga dan sekuens Shine Dalgarno yang berfungsi sebagai situs pengikatan dalam proses translasi. Gen yang telah diamplifikasi disisipkan ke dalam vektor pDONR 221 menggunakan reaksi rekombinasi BP. Vektor rekombinan ditransformasi ke sel inang Escherichia coli DH5α yang telah dibuat kompeten dengan metode heat shock. Plasmid rekombinan dari koloni yang tumbuh di media LB agar dengan kanamisin diisolasi kemudian dianalisis dengan metode PCR dan sekuensing DNA. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen bac2 dari W. confusa MBF8-1 berhasil disisipkan ke dalam vektor sehingga diperoleh plasmid pENT_Wcbac2.

---

Bacteriocins are peptide compounds produced by lactic acid bacteria that inhibit the growth of closely related bacteria. Bacteriocin 2 (bac2) from W. confusa MBF8-1 can be amplified by PCR method and cloned by recombinatorial Gateway® system. Gateway® system affects the specific recombination of bacteriophage lambda that does not require the presence of restriction enzyme and DNA ligase. Gateway® method consists of two steps, first step using bac2 specific primer added by tagged gene and second step using adaptor primer added by tagged gene and Shine Dalgarno sequences as ribosome binding site used for translation process. Amplified gene was inserted into pDONR 221 vector by BP recombination reaction. Recombinant vector was transformed by heat shock method into competent cell Escherichia coli DH5α host. Plasmid recombinant was isolated from colonies that grow in LB agar media with kanamysin, then analyzed by PCR and DNA sequencing method. The result showed that gene of bac2 from W. confusa MBF8-1 was successfully inserted into the vector named pENT_Wcbac2."

"Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) adalah salah satu varian mutan dari protein human EGFR. Mutasi yang terjadi pada EGFR menyebabkan terjadinya kanker. Berbagai mutan EGFR, termasuk EGFRvIII, telah banyak dipelajari karena potensinya sebagai molekul target dalam terapi kanker. Gen penyandi domain ekstraselular EGFRvIII telah berhasil dikonstruksi pada penelitian sebelumnya untuk studi ekspresi protein sebagai molekul target dalam terapi kanker. Penelitian bertujuan untuk subkloning gen EGFRvIII ke dalam plasmid ekspresi pPICZ? dan transformasi plasmid rekombinan ke dalam sel Pichia patoris SMD1168H. Fragmen gen EGFRvIII diperoleh melalui amplifikasi secara in vitro dengan teknik PCR plasmid pJ404-EGFFRvIII-bfp. Gen EGFRvIII tersebut telah terfusi dengan gen bfp penyandi blue fluorescent protein BFP pada ujung-C. Fusi gen tersebut disubklon ke dalam plasmid pPICZ? pada situs XhoI untuk memperoleh plasmid pPICZa-EGFRvIII-bfp. Plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam sel E. coli TOP10 F dengan metode kejut panas. Plasmid rekombinan diseleksi dan dikarakterisasi dengan analisis PCR dan sequencing. Plasmid yang telah dikonfirmasi susunan basa dan ukurannya ditransformasikan ke dalam sel P. pastoris SMD1168H dengan metode elektroporasi untuk ekspresi protein rekombinan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fusi gen EGFRvIII-bfp 1317 bp telah berhasil disubklon ke dalam plasmid pPICZ? dan plasmid rekombinan pPICZ?-EGFRvIII-bfp berhasil ditransformasikan ke dalam P. patoris SMD1168H dengan efisiensi transformasi sebesar 90 CFU/ g DNA plasmid.

---

Epidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII is one of the mutant variant of the EGFR protein. Mutations that occur in EGFR cause cancer. Various mutants of EGFR, including the mutant variant III have been widely studied because of their potential as target molecules in cancer therapy. The extracellular domain coding EGFRvIII gene has been successfully constructed in previous studies for the study of protein expression as a molecule target in cancer therapy. The objective of research are to subclone the EGFRvIII gene into the pPICZ expression plasmid then recombinant plasmid transformation into Pichia patoris SMD1168H cells. Epidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII gene fragment was obtained with in vitro amplification by PCR of pJ404 EGFFRvIII bfp plasmid. Epidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII gene has been fused with the bfp gene encoding blue fluorescent protein BFP at the C end. The gene fusion was subcloned into the pPICZ at the XhoI site to obtain the pPICZa EGFRvIII bfp plasmid. Recombinant plasmid was transformed into E. coli TOP10 F 39 cells by heat shock method. Recombinant plasmids were selected and characterized by PCR analysis and sequencing. The confirmed plasmid of the base structure and size is transformed into the P. pastoris SMD1168H cell by an electroporation method for the expression of the recombinant protein. Results showed that the fusion of the EGFRvIII bfp 1317 bp gene was successfully subcloned into the pPICZ and the recombinant plasmid pPICZ EGFRvIII bfp was successfully transformed into P. patoris SMD1168H with a transformation efficiency of 90 CFU g DNA plasmid."

"Gen Epidermal Growth Factor Receptor Varian III (EGFRvIII) merupakan mutan dari gen EGFR yang terbentuk akibat mutasi delesi ekson 2 sampai 7. Gen EGFRvIII mengkode ekspresi protein EGFRvIII yang hanya diekspresikan pada sel kanker, sehingga protein ini berpotensi untuk digunakan sebagai molekul target dalam terapi kanker yang ditargetkan. dengan antibodi monoklonal. Fragmen anti-EGFRvIII untai tunggal (scFv) adalah antibodi monoklonal yang secara khusus mengenali epitop unik EGFRvIII. Antibodi ini perlu diuji aktivitasnya dengan protein EGFRvIII. Protein EGFRvIII dapat diproduksi dengan menggunakan plasmid pPICZα-EGFRvIII-bfp. pPICZα-EGFRvIII-bfp adalah plasmid rekombinan dengan promotor AOX1 yang tidak dapat digunakan, yang dirancang untuk diubah menjadi P. pastoris sehingga protein EGFRvIII dapat diekspresikan secara ekstraseluler. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan klon P. pastoris transforman yang mengandung gen EGFRvIII dan dapat mengekspresikan protein EGFRvIII. Metode transformasi yang digunakan adalah elektroporasi. Seleksi P. pastoris transforman dilakukan dengan antibiotik zeosin. Gen target pada transforman diverifikasi menggunakan PCR koloni. Ekspresi protein target dilakukan dengan menggunakan teknik induksi metanol. Ekspresi protein dilihat di bawah mikroskop fluoresensi dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan klon P. pastoris transforman yang mengandung gen EGFRvIII-bfp (750 bp) berhasil diperoleh, dengan efisiensi transformasi plasmid 0,003 x 103 cfu/μg. Protein EGFRvIII berhasil diekspresikan berdasarkan pendaran biru protein BFP, tetapi diduga mengalami glikosilasi dan masih menyatu dengan sinyal sekresi karena ukuran protein SDS-PAGE (sekitar ~ 66,2 kDa dan ~ 116 kDa) lebih besar dari ukuran target (~ 41,9 kDa).

---

Epidermal Growth Factor Receptor Variant III (EGFRvIII) gene is a mutant of the EGFR gene which is formed as a result of deletion mutations of exons 2 to 7. The EGFRvIII gene encodes the expression of the EGFRvIII protein which is only expressed in cancer cells, so that this protein has the potential to be used as a target molecule in cancer therapy. targeted. with monoclonal antibodies. The single-stranded anti-EGFRvIII (scFv) fragment is a monoclonal antibody that specifically recognizes the unique epitope of EGFRvIII. These antibodies need to be tested for their activity with the EGFRvIII protein. The EGFRvIII protein can be produced using the plasmid pPICZα-EGFRvIII-bfp. pPICZα-EGFRvIII-bfp is a recombinant plasmid with the unusable AOX1 promoter designed to be converted into P. pastoris so that the EGFRvIII protein can be expressed extracellularly. This study aims to obtain clones of P. pastoris transforman that contain the EGFRvIII gene and can express the EGFRvIII protein. The transformation method used is electroporation. P. pastoris transforman selection was carried out with zeosin antibiotics. The target genes in the transformants were verified using colony PCR. The target protein expression was carried out using methanol induction technique. Protein expression was viewed under a fluorescence microscope and analyzed by SDS-PAGE. The results showed that P. pastoris transforman clones containing the EGFRvIII-bfp (750 bp) gene were successfully obtained, with a plasmid transformation efficiency of 0.003 x 103 cfu/μg. EGFRvIII protein was successfully expressed based on the blue luminescence of BFP protein, but it was suspected to undergo glycosylation and still fuse with the secretion signal because the size of the SDS-PAGE protein (approximately ~ 66.2 kDa and ~ 116 kDa) was larger than the target size (~ 41.9 kDa) ."

"

Protein Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) memiliki peran spesifik dalam menstimulasi poliferasi dan pematangan sel neutrofil. Penelitian sebelumnya, gen CSF3 telah berhasil dikontruksi secara in vitro di dalam vektor pPICZα dengan penyisipan kodon metionin pada ujung-5’ dan kodon stop pada ujung-3’ dari gen CSF3. Kontruksi tersebut menghasilkan pPICZα-metCSF3. Tujuan penelitian ini adalah transformasi plasmid pPICZα-metCSF3 pada sel inang Komagataella phaffii dan melakukan pengujian fenotipe Mut pada sel transforman yang diperoleh. Plasmid pPICZα-metCSF3 diisolasi dari Escherichia coli DH5α dan dilinierisasi sehingga menghasilkan plasmid linier berukuran 4.131 pb. Plasmid rekombinan dipurifikasi dan dikuantifikasi, selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel inang K. phaffii dengan metode elektroporasi. Jumlah koloni yang terbentuk berkisar 214 koloni transforman dan nilai efisiesi transformasi mencapai 0,18 x 10³ cfu/µg plasmid DNA. Seleksi koloni transforman dilakukan pada medium YPD dengan konsentrasi zeosin yang bertingkat. Sebanyak 15 dari 23 koloni transfoman memiliki resistensi terhadap seluruh tingkatan konsentrasi zeosin. Pengujian fenotipe Mut pada 23 koloni transforman memiliki fenotipe Mut⁺. Berdasarkan data pengamatan yang diperoleh bahwa K. phaffii berhasil membawa plasmid pPICZα-metCSF3 dan koloni transforman memiliki keberadaan gen aktif AOX1 dan AOX2 (fenotipe Mut⁺).

---

Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) protein has a specific role to stimulate proliferation and maturation of neutrophils. Previous research has succeeded an in vitro construction of CSF3 gene on pPICZα vector, while inserting a methionine codon at 5’-end and two stop codons at 3’-end of CSF3 gene sequences. The metCSF3 gene has been formed in recombinant plasmid named pPICZα-metCSF3. The purposes of this research are to transform the pPICZα-metCSF3 recombinant plasmid into Komagataella phaffii host and conducting the phenotype Mut analysis on the transformant colonies. The pPICZα-metCSF3 plasmid was isolated from Escherichia coli DH5α and was linearized to 4.131 bp of plasmid in size. pPICZα-metCSF3 plasmid was purified and quantified, then it was transformed into K. phaffii through electroporation method. Approximately 214 transformant colonies successfully produced and the transformation efficiency reached up to 0,18 x 10³ cfu/µg of DNA plasmid. The transformant was selected on YPD medium with increasing zeocin concentration. Approximately 15 out of 23 transformant were resistant against all stage of zeocin concentration. The determination of Mut phenotype on 23 transformant colonies categorized as Mut⁺ phenotype. In brief, K. phaffii has been succeded to bring pPICZα-metCSF3 plasmid and transformant colonies have active AOX1 and AOX2 gene (Mut⁺ phenotype).

"

"

Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) telah ditemukan sebagai protein reseptor spesifik pada beberapa jenis sel kanker. Protein tersebut merupakan hasil ekspresi dari salah satu jenis mutan gen EGFR, yaitu gen EGFRvIII. Mutasi pada gen EGFRvIII terjadi karena adanya delesi ekson  2  hingga 7 yang merupakan bagian dari domain ekstraselular yang berinteraksi dengan ligan alaminya. Keberadaan EGFRvIII yang spesifik hanya pada sel kanker memberikan potensi bagi protein tersebut untuk dijadikan sebagai molekul target pada terapi penargetan kanker dengan antibodi monoklonal. Fragmen antibodi untai tunggal (ScFv) anti-EGFRvIII merupakan antibodi monoklonal yang dapat digunakan sebagai ligan spesifik terhadap EGFRvIII dalam simulasi terapi penargetan kanker. Antibodi ScFv-anti-EGFRvIII dapat diproduksi menggunakan plasmid pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp. Plasmid rekombinan ini memiliki promotor indusibel AOX1 dan sinyal sekresi matting factor-a yang dapat ditransformasikan pada Komagataella phaffii sehingga antibodi ScFv-anti-EGFRvIII dapat disekresikan oleh sel inang. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan klona K. phaffii transforman yang membawa gen ScFv-anti-EGFRvIII. Plasmid diisolasi dari Escherichia coli TOP10F` dan dipurifikasi dengan pelarut organik. Plasmid kemudian dipotong dengan enzim SacI sehingga diperoleh plasmid linear yang berukuran 5.150 bp. Metode transformasi yang digunakan adalah elektroporasi. Seleksi K. phaffii transforman dilakukan pada medium seleksi yang mengandung antibiotik zeocin. Hasil penelitian menunjukkan klona K. phaffii transforman yang mengandung plasmid rekombinan  pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp (5150 bp) berhasil diperoleh. Hasil seleksi K. phaffii transforman dengan replica platting menunjukkan, bahwa seluruh koloni tunggal transforman yang terpilih dapat tumbuh dengan baik pada konsentrasi zeocin 100 μg/mL. Hal tersebut mengindikasikan, bahwa plasmid rekombinan pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp dapat berintegrasi ke dalam genom K. phaffii secara stabil.

 

---

Cancer is a disease caused by abnormal proliferation of cell which can produce fatal effects for an organ system. Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) has been found to be a spesific receptor protein in several tyoes of cancer cells. The protein is expressed by one of many types of mutant from EGFR gene, namely EGFRvIII. Mutation in EGFRvIII gene occur because of deletion on exon 2 to exon 7 that are part of the extracellular domain that interacts with their natural ligand. The specificity of EGFRvIII on cancer cells EGFRvIII provides a potential for the protein to be used as target molecule in cancer-targeting therapy with monoclonal antibodies. Single-chain variable fragment (ScFv) of anti-EGFRvIII is a monoclonal antibody that can be used as specific ligands against EGFRvIII in simulating cancer-targeting theraphy. The ScFv-anti-EGFRvIII antibody can be produced using the pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp plasmid. This recombinant plasmid has an inducible AOX1 promoter and matting factor-a secretion signal that can be transformed into Komagataella phaffii so that the ScFv-anti-EGFRvIII antibody can be expressed extracellularly. The purpose of this study is to obtain a K. phaffii transformant clone that carries the ScFv-anti-EGFRvIII gene. The plasmid were isolated from Escherichia coli TOP10F` and purified. Plasmid were then cut with the SacI enzym so that a 5.150 bp linear plasmid was obtained. The method of transformation in this study is electroporation. The selection of K. phaffii transformant was carried out on a selection medium containing zeocin antibiotic. The results showed that K. phaffii transformant clone containing pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp (5150 bp) recombinant plasmid was succesfully obtained. The selection of K. phaffii transforman with replica platting shows that all selected single colony transformants can grow well at zeocin concentration of 100 μg/mL. The result indicate that the pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp recombinant plasmid can be integrated into K. phaffii genome stably.

 

"

"

Imunoterapi merupakan metode terapi kanker yang sedang berkembang namun belum tersedia bebas di Indonesia karena biayanya yang mahal. Salah satu cara kerjanya adalah dengan menargetkan bagian spesifik dari sistem imun untuk membentuk respon terhadap sel ganas dan meningkatkan apoptosis sel menggunakan antibodi monoklonal. Contohnya reseptor PD1 yang berfungsi untuk menghalangi ligan PD1 yang banyak terdapat pada permukaan sel kanker. Riset ini bertujuan untuk mendapatkan plasmid rekombinan epitop PD1 EP2 yang akan dipergunakan dalam riset payung tim PRVKP. Rekombinasi DNA dilakukan dengan memasukan fragmen DNA PD1 EP2 yang telah diperbanyak dan dipotong ke dalam plasmid pQE-80L. Hasil ligasi kemudian ditransformasi dalam bakteri E.coli TOP10 dan dianalisa dengan PCR koloni. Produk PCR terbukti mengandung plasmid rekombinan PQE EP2. Konfirmasi selanjutnya dengan analisa sekuens DNA memastikan kandungan basa pada fragment insert telah terekspresi dalam plasmid. Sekuensing koloni ke 12 menunjukan bahwa insert telah terekspresi tanpa mutasi. Beberapa protokol ditemukan berpotensi mengurangi kemungkinan keberhasilan studi ini namun penelitian lebih lanjut. Dikarenakan hasil analisa ulang situs restriksi HindIII pada sekuens DNA tidak dapat memberi kepastian, sekuensing ulang disarankan untuk dilakukan. Protokol PRVKP disarankan untuk disempurnakan kembali.

---

Immunotherapy is a flourishing method for cancer treatment that is not available in Indonesia due to its expensive cost. One of its working method is by targeting a specific part of immune system to induce response against cancer cell and increase cell apoptosis with monoclonal antibodies. As example, PD1 receptor which function is to inhibit PD1 ligands abundantly found at the surface of cancer cell. This research focused on obtaining PD1 EP2 epitope recombinant plasmid to create the PD1 monoclonal antibody that is being develop by PRVKP team. DNA recombination was performed by inserting PD1 EP2 epitope's fragment into pQE-80L plasmid. Ligation product was then transformed into E.coli TOP10 bacteria and analyzed with colony PCR. PCR product had been proven to yield several colonies which contain PQE EP2 recombinant plasmid. Next, sequence analysis was conducted to confirm correct insert fragment was successfully expressed in plasmid. The 12th colony sequence was confirmed to contain non-mutated bases. Several protocol were found to potentially decrease the chance of success, yet further examination was not executed as it was not the focus of the research. As reanalysis of HindIII restriction site in recombinant sequence remained inconclusive, resequencing was suggested. PRVKP protocols adjustment was advised.

"

"Keamanan dari vaksin terapetik untuk kanker serviks yang didasarkan pada antigen HPV E6 perlu dipastikan dengan uji interaksi antara vaksin dan protein p53. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan plasmid rekombinan untuk ekspresi protein rekombinan p53 yang akan digunakan dalam uji interaksi. Enzim RevertAid dan primer random hexamer digunakan untuk mendapatkan cDNA dari sel HeLa yang akan digunakan sebagai cetakan PCR dengan menggunakan enzim Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity dan primer p53 spesifik. Produk PCR yang dihasilkan sebesar 1204 bp yang mengandung gen p53 dengan adanya penambahan situs restriksi endonuklease SalI dan PstI. Setelah pemotongan dengan enzim SalI dan PstI, produk PCR diligasi dengan plasmid pQE-80L yang juga sudah dipotong dengan enzim yang sama. Campuran ligasi digunakan untuk transformasi ke dalam Escherichia coli TOP10. Keberadaan fragmen DNA p53 yang berhasil dimasukkan ke dalam plasmid rekombinan yang sudah berada di dalam transforman diverifikasi menggunakan PCR, pemotongan DNA rekombinan, dan sekuensing. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen p53 manusia berhasil diklon ke pQE-80L dengan adanya mutasi pada urutan basa nukleotida ke-386.

---

In order to confirm the safety of a therapeutic vaccine for cervical cancer that is based on HPV E6 antigen, an interaction assay between the vaccine and the p53 protein is required. The aim of this study is to obtain a recombinant plasmid for expression of p53 recombinant protein that will be used in the interaction assay. The RevertAid enzyme and random hexamer primer was employed to obtain cDNA from HeLa cell that will be used as template in PCR using the Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity enzyme and p53 specific primer set, to generate a 1204 bp PCR product containing the p53 gene, with flanking SalI and PstI endonuclease restriction sites. Following restriction with SalI and PstI enzyme, the PCR product was ligated with the plasmid pQE 80L that has been linearized by restriction with the same enzymes. The ligation mixture was used for transformation of Escherichia coli TOP10. The presence of the inserted p53 DNA fragment in the recombinant plasmid harboured by the transformants was verified using PCR, digestion of recombinant plasmids, and sequencing. The results showed that the human p53 gene was successfully cloned into pQE 80L with a mutation at position 386 of the p53 nucleotide base sequence."

"Peran protein retinoblastoma (pRb) dalam pencegahan pembentukan tumor diinhibisi oleh interaksinya dengan protein E7 HPV pada kanker serviks. Oleh sebab itu, perlu dilakukan strategi pengembangan uji in vitro untuk analisis interaksi pRb dan E7, terutama dalam pengembangan vaksin HPV berbasis antigen E7. Protein pRb dapat diperoleh dalam bentuk protein rekombinan yang diproduksi pada bakteri Escherichia coli. Penelitian bertujuan untuk memperoleh klona gen RB1 dalam vektor pQE_80L. Sintesis gen RB1 (2787 pb) dilakukan dengan metode PCR overlap extension. Fragmen gen RB1 dan vektor didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan SalI kemudian diligasikan dengan enzim T4 ligase. Hasil ligasi ditransformasi ke dalam Escherichia coli TOP10 secara kejut panas. Hasil transformasi diseleksi menggunakan PCR koloni untuk mengidentifikasi keberadaan DNA sisipan. Sebanyak 1 dari 27 koloni yang diseleksi mengandung plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan kemudian diisolasi dan diverifikasi dengan digesti dan sekuensing. Hasil analisis digesti dan sekuensing menunjukkan gen RB1 berhasil disisipkan ke vektor pQE_80L. Namun terdapat beberapa mutasi, yaitu substitusi (c.117G>A dan c.2316T>C) serta mutasi delesi (c.719_724delAAACAG).

---

The role of human retinoblastoma protein (pRb) as tumor suppressor is inhibited by its interaction with HPV E7 protein in cervical cancer. Therefore, it is interesting to develop strategy for development of in vitro assay to analyze pRb and E7 interaction, especially in the development of therapeutic HPV vaccine that is based on E7 antigen. The pRb protein can be provided in the form of recombinant protein that is poduced in Escherichia coli. The study objective was to obtain RB1 gene clone in pQE_80L vector. The synthesis of RB1 gene (2787 pb) was performed by using overlap extension PCR. The RB1 gene fragment and vector was digested by BamHI and SalI restriction enzyme then ligated by T4 ligase enzyme. The ligation product was transformed into Escherichia coli TOP10 with heat shock. The transformation result was screened using colony PCR to identify the presence of insert DNA. There was 1 out of 27 selected colonies that carried the recombinant plasmid. The recombinant plasmid then isolated and verified with digestion and sequencing. The results of digestion and sequencing analysis showed that RB1 gene was successfully inserted into pQE_80L vector. However, there were mutations which were substitution (c.117G>A and c.2316T>C) and deletion (c.719_724delAAACAG)."