Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Kanker serviks yang banyak menyerang wanita di dunia disebabkan oleh human papillomavirus. Gen Late-2 (L2) human papillomavirus adalah gen yang menyandi protein kapsid minor dan memiliki daerah conserved yang mampu menginduksi cross-neutralizing antibodies. Penelitian bertujuan memperoleh klona gen L2. Gen L2 diamplifikasi menggunakan primer L2F (forward) dan L2R (reverse) serta diligasi dengan vektor pBluescript II KS (+) yang sebelumnya didigesti dengan enzim NotI. Hasil ligasi ditansformasi menggunakan metode kejutan panas ke dalam Escherichia coli TOP10 yang sebelumnya telah dibuat menjadi kompeten. Hasil efisiensi transformasi adalah 5,8 x 105 cfu/μg. Hal tersebut menunjukkan E. coli cukup kompeten karena berada pada kisaran antara 5 x 105—2 x 107 cfu/μg. Hasil transformasi ditumbuhkan dalam medium LB agar berampisilin yang telah ditambahkan X-gal dan IPTG. Sebanyak lima koloni putih dan 10 koloni biru tumbuh dalam medium, namun tak satupun koloni putih tersebut membawa plasmid rekombinan. Hasil analisis menunjukkan gen L2 belum berhasil diklona. Adanya koloni putih kemungkinan disebabkan mutasi, sedangkan sedikitnya koloni yang tumbuh disebabkan proses ligasi yang tidak berhasil."

"Pada dua dekade terakhir ini, telah dikembangkan suatu metode deteksi infeksi HPV yang memiliki tingkat akurasi sensitifitas yang jauh lebih tinggi dibandingkan Pap Smear, yaitu Hybrid Capture. Peneihian ini bertujuan untuk mendapatkan rancangan primer secara in silica sebagai pengganti probe untuk memodifikasi Hybrid Capture. Sekuens DNA HPV didapat dari database Los Alamos National Laboratory. Sekuens genom HPV hanya difokuskan pada daerah Late Gene (L 1 dan L2) yang berfungsi untuk menyandi protein kapsid (pembungkus) HPV. Sequence alignment dilakukan masing-masing untuk sekuens L 1 dan L2 HPV dari database yang bertujuan untuk mencari kesamaan antar sekuens. Hasil yang diperoleh adalah conserved region antar sekuens nukleotida sebagai template pelekatan primer. Agar hasil analisis conserved region dapat dipertanggung jawabkan, maka perlu dilakukan database similiarity searching melalui Basic Local Alignment Search Tool (BLA?T). Diperoleh 7 region terbaik, yaitu region 1 dari hasil alignment daerah gen L 1 tipe HPV 16; 18; 31; 45. Region 21, 31,43,45, 46 dari hasil alignment daerah gen L 1 tipe HPV 11; 16; 18; 31; 35; 68 Regi?n 52 dari hasil alignment daerah gen L2 tipe HPV 16; 18; 52."

"Keamanan dari vaksin terapetik untuk kanker serviks yang didasarkan pada antigen HPV E6 perlu dipastikan dengan uji interaksi antara vaksin dan protein p53. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan plasmid rekombinan untuk ekspresi protein rekombinan p53 yang akan digunakan dalam uji interaksi. Enzim RevertAid dan primer random hexamer digunakan untuk mendapatkan cDNA dari sel HeLa yang akan digunakan sebagai cetakan PCR dengan menggunakan enzim Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity dan primer p53 spesifik. Produk PCR yang dihasilkan sebesar 1204 bp yang mengandung gen p53 dengan adanya penambahan situs restriksi endonuklease SalI dan PstI. Setelah pemotongan dengan enzim SalI dan PstI, produk PCR diligasi dengan plasmid pQE-80L yang juga sudah dipotong dengan enzim yang sama. Campuran ligasi digunakan untuk transformasi ke dalam Escherichia coli TOP10. Keberadaan fragmen DNA p53 yang berhasil dimasukkan ke dalam plasmid rekombinan yang sudah berada di dalam transforman diverifikasi menggunakan PCR, pemotongan DNA rekombinan, dan sekuensing. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen p53 manusia berhasil diklon ke pQE-80L dengan adanya mutasi pada urutan basa nukleotida ke-386.

---

In order to confirm the safety of a therapeutic vaccine for cervical cancer that is based on HPV E6 antigen, an interaction assay between the vaccine and the p53 protein is required. The aim of this study is to obtain a recombinant plasmid for expression of p53 recombinant protein that will be used in the interaction assay. The RevertAid enzyme and random hexamer primer was employed to obtain cDNA from HeLa cell that will be used as template in PCR using the Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity enzyme and p53 specific primer set, to generate a 1204 bp PCR product containing the p53 gene, with flanking SalI and PstI endonuclease restriction sites. Following restriction with SalI and PstI enzyme, the PCR product was ligated with the plasmid pQE 80L that has been linearized by restriction with the same enzymes. The ligation mixture was used for transformation of Escherichia coli TOP10. The presence of the inserted p53 DNA fragment in the recombinant plasmid harboured by the transformants was verified using PCR, digestion of recombinant plasmids, and sequencing. The results showed that the human p53 gene was successfully cloned into pQE 80L with a mutation at position 386 of the p53 nucleotide base sequence."

"Peran protein retinoblastoma (pRb) dalam pencegahan pembentukan tumor diinhibisi oleh interaksinya dengan protein E7 HPV pada kanker serviks. Oleh sebab itu, perlu dilakukan strategi pengembangan uji in vitro untuk analisis interaksi pRb dan E7, terutama dalam pengembangan vaksin HPV berbasis antigen E7. Protein pRb dapat diperoleh dalam bentuk protein rekombinan yang diproduksi pada bakteri Escherichia coli. Penelitian bertujuan untuk memperoleh klona gen RB1 dalam vektor pQE_80L. Sintesis gen RB1 (2787 pb) dilakukan dengan metode PCR overlap extension. Fragmen gen RB1 dan vektor didigesti dengan enzim restriksi BamHI dan SalI kemudian diligasikan dengan enzim T4 ligase. Hasil ligasi ditransformasi ke dalam Escherichia coli TOP10 secara kejut panas. Hasil transformasi diseleksi menggunakan PCR koloni untuk mengidentifikasi keberadaan DNA sisipan. Sebanyak 1 dari 27 koloni yang diseleksi mengandung plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan kemudian diisolasi dan diverifikasi dengan digesti dan sekuensing. Hasil analisis digesti dan sekuensing menunjukkan gen RB1 berhasil disisipkan ke vektor pQE_80L. Namun terdapat beberapa mutasi, yaitu substitusi (c.117G>A dan c.2316T>C) serta mutasi delesi (c.719_724delAAACAG).

---

The role of human retinoblastoma protein (pRb) as tumor suppressor is inhibited by its interaction with HPV E7 protein in cervical cancer. Therefore, it is interesting to develop strategy for development of in vitro assay to analyze pRb and E7 interaction, especially in the development of therapeutic HPV vaccine that is based on E7 antigen. The pRb protein can be provided in the form of recombinant protein that is poduced in Escherichia coli. The study objective was to obtain RB1 gene clone in pQE_80L vector. The synthesis of RB1 gene (2787 pb) was performed by using overlap extension PCR. The RB1 gene fragment and vector was digested by BamHI and SalI restriction enzyme then ligated by T4 ligase enzyme. The ligation product was transformed into Escherichia coli TOP10 with heat shock. The transformation result was screened using colony PCR to identify the presence of insert DNA. There was 1 out of 27 selected colonies that carried the recombinant plasmid. The recombinant plasmid then isolated and verified with digestion and sequencing. The results of digestion and sequencing analysis showed that RB1 gene was successfully inserted into pQE_80L vector. However, there were mutations which were substitution (c.117G>A and c.2316T>C) and deletion (c.719_724delAAACAG)."

"ABSTRAKHuman papillomavirus HPV adalah virus DNA yang dapat menginfeksi bagian basal sel epitel leher rahim wanita melalui luka sehingga meningkatkan kasus kanker serviks di Indonesia. Penelitian mengenai pengembangan obat terhadap penyakit kanker serviks berbasis vaksin DNA terapeutik telah dilakukan melalui konstruksi plasmid rekombinan antigen E7 HPV-16 pada sistem ekspresi mamalia. Vektor plasmid pcDNA 3.1 5.428 pb yang digunakan pada penelitian berhasil dikonstruksi melalui proses digesti pada situs NheI dan ligasi dengan fragmen acak gen E7 294 pb sehingga membentuk plasmid rekombinan pcDNA-E7 CADB. Plasmid rekombinan hasil ligasi diklona ke dalam sel E. coli TOP 10 melalui proses transformasi heat shock. Analisis hasil penelitian menunjukkan bahwa 5 koloni mengandung plasmid rekombinan pcDNA-E7 CADB. Analisis orientasi arah gen melalui PCR dan digesti pada 5 koloni menghasilkan 2 koloni plasmid positif dengan arah orientasi 5 rsquo; ke 3 rsquo; pada koloni nomor 5 dan 7. Kedua koloni menunjukkan bahwa fragmen gen E7 CADB berhasil disisipkan pada vektor pcDNA 3.1 dan berhasil diklona ke dalam E. coli TOP 10.

---

ABSTRACTHuman papillomavirus HPV is a DNA virus that can infects the basal cells of the female cervix through wounds in which it may increase the risk of cervical cancer in Indonesia. There has been a drug development research to treat cervical cancer based on therapeutic DNA vaccine via constructing recombinant plasmid of HPV 16 E7 in mammalian expression system. pcDNA 3.1 plasmid vectors 5.428 bp which were used in this research are successfully construced through the digestion process at NheI site and the ligation process with shuffling fragments of E7 gene 294 bp which created pcDNA E7 CADB recombinant plasmid. Recombinant plasmid which is the result of the ligation process is cloned into TOP 10 Escherichia coli cell through a transformation process called heat shock. The result of this research displays 5 colonies containing pcDNA E7 CADB recombinant plasmid. Analysis of gene direction orientation through PCR and digestion of 5 colonies displays positive plasmid on 2 colonies with 5 rsquo ndash 3 rsquo direction on colony unit 5 and colony unit 7. Result of the 2 colony shows that E7 CADB gene fragment successfully inserted into the NheI site of pcDNA 3.1. It also resulted in cloning completion of E7 CADB gene fragments into TOP 10 E. coli."

"Infeksi HIV-1 merupakan salah satu permasalahan kesehatan di Indonesia yang perlu diteliti untuk mendapatkan strategi intervensi yang sesuai dengan galur virus yang bersirkulasi di Indonesia. Untuk pengembangan kultur galur HIV Indonesia, diperlukan antibodi spesifik terhadap protein awal HIV-1 yaitu Tat dan Rev sebagai marka infeksi HIV pada sel yang terinfeksi HIV-1. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan plasmid pengekspresi bagian immunodominant protein fusi Tat dan Rev pada sistem ekspresi mamalia agar dapat dimanfaatkan untuk menginduksi pembentukan antibodi spesifik pada hewan coba mamalia. Susunan DNA penyandi protein fusi Tat dan Rev didapat dengan melakukan analisis optimasi kodon penyandi susunan asam amino protein fusi menggunakan piranti lunak GenScript, untuk mendapatkan nilai Codon Adaptation Index CAI > 0.80 pada sistem ekspresi mamalia. Susunan nukleotida yang diperoleh kemudian diberikan tambahan susunan nukleotida situs restriksi pada bagian 5 rsquo; dan 3 rsquo; untuk memudahkan pengklonaan ke dalam vektor ekspresi dan dipesan ke penyedia jasa sintesis asam nukleat. Potongan DNA sisipan TatRev, penyandi protein fusi TatdanRev diperoleh dari penyedia jasa sintesis dalam bentuk terklona dalam plasmid pUC19. Agar dapat terekspresi dalam sistem ekspresi mamalia, DNA sisipan dipotong dengan enzim restriksi KpnI dan HindIII dari plasmid pUC19 dan disubklona ke dalam situs restriksi KpnI dan HindIII pada plasmid pTriEx-4. Analisis restriksi enzim Kpn I dan Hind III plasmid rekombinan yang diperoleh dengan elektroforesis jel agarosa menunjukkan adanya dua pita yang bermigrasi sesuai ukuran plasmid pTriEx-4 dan DNA sisipan TatRev, yaitu sebesar 5000 pb dan 600 pb.

---

HIV 1 infection is one of the health problems in Indonesia that is necessary to be studied in order to obtain intervension strategies that is in accordance with the circulating viral strains in Indonesia. In order to develop culture of Indonesian HIV strainss, specific antibodies towards early proteins of HIV, namely Tat and Rev, that are markers of HIV infection in HIV 1 infected cells. This study is aimed at obtaining a plasmid for expression of immunodominant region of Tat and Rev fusion protein in mammalian expression system to be used for stimulation of specific antibody formation in mammals as experimental animal. Nucleotide sequence of DNA encoding the Tat and Rev fusion protein was obtained by codon optimization analysis of the amino acid sequence of the fusion protein using the GenScript software, to obtain a Codon Adaptation Index CAI 0.80 for mammalian expression system. The nucleotide sequence that is obtained was then added with recognition sequences for enzymatic restriction at the 5 rsquo and 3 rsquo end to facilitate cloning into expression vector, and requested to a service provider for nucleic acid synthesis. The TatRev insert DNA, encoding the fusion protein of Tat and Rev was obtained from the nucleic acid synthesis service provider in the formed of cloned DNA in the plasmid pUC19. For expression in mammalian expression system, the insert DNA was restricted using restriction enzymes KpnI and HindIII from the pUC19 plasmid and subcloned into the KpnI and HindIII restriction sites in plasmid pTriEx 4. Agarose gel electrophoresis analysis of KpnI and HindIII enzymatic restriction of the resulting recombinant plasmid showed the presence of two bands that migrated according to the sizes of the plasmid pTriEx 4 and the TatRev insert DNA, namely 5000 bp and 600 bp."

"Masih tingginya penderita kanker serviks dan keterbatasan vaksin profilaktik yang tidak memiliki efek terapeutik mendorong dikembangkannya vaksin Human Papillomavirus HPV yang bersifat terapeutik. Salah satu protein Human Papillomavirus HPV yang berpotensi sebagai vaksin terapeutik yaitu protein E6. Protein E6 yang bersifat alamiah diperlukan sebagai kontrol dalam uji keamanan vaksin. Studi ini bertujuan untuk mengekspresikan gen E6 yang sebelumnya telah diklona pada vektor pGEX-6P-1. Verifikasi plasmid rekombinan E6 dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa, double digest, dan sekuensing. Ekspresi protein dilakukan pada sistem ekspresi prokariota yaitu Escherichia coli BL21-CodonPlus DE3. Ekspresi protein dilakukan pada suhu 37 C dan diinduksi IPTG dengan konsentrasi akhir 0,2 mM, 0,4 mM, dan 1 mM. Protein yang telah diperoleh divisualisasi dengan SDS-PAGE 12 dan dikarakterisasi dengan western blot. Analisis menggunakan perangkat lunak genscript menunjukan bahwa ekspresi protein E6 memiliki laju ekspresi yang rendah dengan nilai Codon Adaptation Index CAI 0,57, kandungan GC 38,56, dan Codon Frequency Distribution CFD 20 . Keberadaan protein E6 dideteksi dengan western blot menggunakan antibodi poliklonal dan hasil western blot menunjukkan adanya protein E6 berukuran 44 kDa.

---

The high prevalence of cervical cancer and the limited prophylactic vaccine that does not have a therapeutic effect encourage the development of the therapeutic Human Papillomavirus HPV vaccine. One of the proteins of Human Papillomavirus HPV which is potential as a therapeutic vaccine is E6 protein. A natural E6 protein is required as a control in vaccine safety testing. This study aims to express the previously cloned E6 gene in the pGEX 6P 1 vector. Verification of recombinant plasmid E6 was performed with agarose gel electrophoresis, double digest, and sequencing. Protein expression was performed on the prokaryotic expression system Escherichia coli BL21 CodonPlus DE3. Protein expression was performed at 37 C and induced with IPTG with a final concentration of 0.2 mM, 0.4 mM, and 1 mM and was characterized by western blot. The obtained protein was visualized with SDS PAGE 12. Analysis using genscript software showed that E6 protein expression had low expression rate with Codon Adaptation Index CAI 0,57, GC content 38,56, and Codon Frequency Distribution CFD 20. The presence of E6 protein was detected by western blot using polyclonal antibody and the western blot result indicated the presence of E6 protein at 44 kDa."

"ABSTRAKLatar Belakang: Persistensi infeksi HPV onkogenik merupakan penyebab kanker serviks. Retinol sebagai mikronutrien antioksidan memiliki peran esensial dalam sistem imun mencegah persistensi. Retinol memodulasi sel T CD4+/CD8+ serta produksi sitokin. Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-) adalah sitokin pro-inflamasi yang mampu mengendalikan HPV, namun pada infeksi persisten TNF- justru memicu karsinogenesis. Rasio sel T CD4+:CD8+ dan TNF- yang adekuat di awal infeksi HPV merupakan titik kunci klirens. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat kecukupan deposit retinol, ekspresi TNF-, dan rasio sel T CD4+:CD8+ pada kelompok serviks normal, infeksi subklinis HPV klirens, persisten, dan kanker serviks.Metode: Tingkat kecukupan deposit retinol diketahui berdasarkan pemeriksaan darah perifer dengan metode ELISA. Stimulasi spesifik epitop E6 HPV tipe 16 dilakukan pada sel sekret servikovaginal yang telah diinkubasi 24 jam, diamati ekspresi TNF- secara semikuantitatif dengan metode ELISpot. Pemeriksaan sel T CD4+ dan CD8+ dari sekret servikovaginal secara kuantitatif dengan metode flowsitometri.Hasil: Deposit retinol yang cukup pada kelompok serviks normal, infeksi subklinis HPV klirens, persisten, dan kanker serviks berturut-turut adalah 85%, 75% (OR 1,89), 33,3% (OR 11,33), dan 75% (OR 1,89). Ekspresi TNF- pada kelompok serviks normal adalah 10%, sedangkan kanker serviks 75% (OR 27,00; p<0,001). Tidak tampak ekspresi TNF- pada kelompok infeksi subklinis HPV klirens dan persisten. Rasio sel T CD4+:CD8+ yang tinggi pada kelompok serviks normal adalah 10% dan kanker serviks 25% (OR 0,33). Tidak terdapat rasio sel T CD4+:CD8+ yang tinggi pada kelompok infeksi subklinis HPV klirens (OR 1,22) dan persisten (OR 0,95). Tidak terdapat hubungan bermakna antara tingkat kecukupan deposit retinol dengan ekspresi TNF- (p=0,147), tingkat kecukupan deposit retinol dengan rasio sel T CD4+:CD8+ (p=0,726), dan rasio sel T CD4+:CD8+ dengan ekspresi TNF- (p=0,690).Kesimpulan: Penelitian ini mampu membuktikan bahwa tingkat kecukupan deposit retinol tertinggi dijumpai pada kelompok serviks normal dan ekspresi TNF- tertinggi pada kelompok kanker serviks (OR 27,00; p<0,001). Tingkat kecukupan deposit retinol terendah bukan pada kelompok kanker serviks, melainkan pada infeksi subklinis HPV persisten (OR 11,33). Tidak terdapat perbedaan bermakna pada tingkat kecukupan deposit retinol dan rasio sel T CD4+:CD8+. Terdapat perbedaan bermakna pada ekspresi TNF- antara kelompok kanker serviks dengan serviks normal (p<0,001), kanker serviks dengan infeksi HPV subklinis klirens (p=0,024), dan klirens dengan persisten (p=0,007). Tidak terdapat perbedaan bermakna ekspresi TNF- antara kelompok kanker serviks dengan infeksi HPV subklinis persisten (p=0,058). Tidak bermaknanya beberapa hasil terkait imunitas masih mungkin dikarenakan tingkat kecukupan deposit retinol kelompok kanker serviks pada penelitian ini sangat baik dimana bertentangan dengan kepustakaan.

---

ABSTRACT

Background: Persistency of oncogenic-HPV infection is the cause of cervical cancer. Retinol is one of antioxidant micronutrients that plays essential roles in immune system to prevent the persistency by modulating CD4+ and CD8+T cells and cytokines production. Tumor Necrosis Factor-Alpha (TNF-) is an acute pro-inflammatory cytokine which has many crucial roles in controlling HPV. In contrast, when persistent infection occurs, TNF- induces carcinogenesis. Ratio of CD4+:CD8+ T cells and adequate TNF- production in acute HPV infection are keypoints for clearance. The aim of this research is to analyze sufficency level of retinol deposit, expression of TNF-, and ratio of CD4+:CD8+ T cells in normal cervix, clearance and persistent HPV subclinical infection, and cervical cancer group.

Methods : Sufficiency level of retinol deposit was analyzed from peripheral blood by ELISA method. The cervicovaginal secretions which had 24 hours incubated were stimulated specifically by E6 epitope HPV type-16, measuring TNF- expression semiquantitatively by ELISpot method and CD4+/CD8+ T cells quantitatively by flowcytometry method.

Results: Sufficient level of retinol deposit in normal cervix, clearance HPV subclinical infection, persistent, and cervical cancer group was 85%, 75% (OR 1.89), 33.3% (OR 11.33), and 75% (OR 1.89), respectively. The expression of TNF- in normal cervix group was 10%, while in cervical cancer was 75% (OR 27.00; p<0.001). There were no expression in clearance and persistent HPV subclinical infection groups. High ratio of CD4+:CD8+ T cells in normal cervix and cervical cancer group was 10% and 25% (OR 0.33). There were no high ratio of CD4+:CD8+ T cells in clearance (OR 1,22) and persistent (OR 0.95) HPV subclinical infection groups. There was no significant correlation between sufficiency level of retinol deposit and TNF- expression (p=0.147), sufficiency level of retinol deposit and ratio of CD4+:CD8+ T cells (p=0.726), ratio of CD4+:CD8+ T cells and TNF- expression (p=0.690).

Conclusions: This study was able to prove that normal cervix group has the highest retinol deposit sufficiency level and cervical cancer group has the highest TNF- expression (OR 27,00; p<0,001). The lowest of retinol deposit sufficiency level was not in cervical cancer, but in persistent HPV subclinical infection group (OR 11.33). There was no significant correlation in sufficiency level of retinol deposit and ratio of CD4+:CD8+ T cells. There was significant correlation in TNF- expression between cervical cancer and normal cervix (p<0.001), cervical cancer and clearance subclinical HPV infection (p=0.024), and between clearance and persistent group (p=0.007). There was no significant correlation in TNF- expression between cervical cancer and persistent subclinical HPV infection group (p=0.058). Not significant some results related immunity that might be due to retinol deposit sufficiency level in cervical cancer group in this study was very good, which conflicted with literatures."