Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Transfeksi merupakan proses memasukkan materi genetik ke dalam sel mamalia, yang umumnya digunakan untuk keperluan terapi gen dan produksi obat-obatan berbahan biologis (biologics) dari kultur sel mamalia. Pengantaran materi genetik melalui senyawa lipid (lipofeksi) merupakan metode transfeksi paling diminati karena sifatnya yang tidak toksik, mudah digunakan, terjangkau, dan memiliki nilai efisiensi transfeksi yang baik. Lipopeptida Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) merupakan agen lipofeksi hasil pengembangan Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) yang diharapkan mampu menjadi kompetitor agen lipofeksi komersial yang sudah ada di pasar, akan tetapi kemampuannya dalam menginduksi produk biologis pada galur sel mamalia Chinese Hamster Ovary K1 (CHO-K1) belum terkarakterisasi dengan baik. Berkenaan dengan itu, proinsulin merupakan produk biologis bernilai tinggi yang pengembangannya juga sedang dilakukan oleh BPPT. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan klon plasmid proinsulin rekombinan serta mendeteksi produksi proinsulin hasil transfeksi plasmid yang menggunakan lipopeptida Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) pada galur sel mamalia CHO-K1. Deteksi dilakukan melalui metode immunofluorescence assay (IFA) dan western blotting (WB). Hasil menunjukkan bahwa telah didapat 6 klon plasmid proinsulin rekombinan, dengan 1 klon terbukti fungsional karena mampu menginduksi ekspresi proinsulin dengan ukuran protein yang benar di dalam sel CHO-K1. Uji IFA dari hasil transfeksi yang menggunakan lipopeptida Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) menunjukkan adanya perbedaan signifikan antara nilai Corrected Cell Total Fluorescence (CTCF) sel pasca transfeksi proinsulin rekombinan dan sel pasca transfeksi plasmid non-rekombinan pEGFP-N1. Uji pasca transfeksi yang menggunakan lipopeptida Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) konsisten dengan pengujian IFA dan WB pasca transfeksi yang menggunakan agen lipofeksi komersial TurboFect™. Dapat disimpulkan bahwa protein proinsulin berhasil diekspresikan pasca transfeksi menggunakan lipopeptida Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) pada galur sel mamalia CHO-K1.

---

The process of introducing genetic materials into mammalian cells is known by transfection, which holds value in gene therapy and the production of biologics in mammalian cell culture. Among methods of transfection, deliverance through lipid particles or lipofection is the most favorable one because of several advantages. Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) is a novel lipofection agent developed by the Agency for the Assessment and Application of Technology (BPPT) to compete with its successor in the field of lipofection, but its capability of inducing the production of biologics in CHO-K1 mammalian cell line was not characterized well. In the meantime, the same agency has been working on recombinant proinsulin, a highly valued biological product. The aims of this research are first to obtain clones of recombinant proinsulin and second to detect the presence of proinsulin in CHO-K1 cells post-transfected with recombinant proinsulin using Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS) lipopeptide. Protein detection is done through immunofluorescence assay (IFA) and western blotting (WB). Six plasmid clones of recombinant proinsulin have been obtained, with one clone proved to be functional in expressing proinsulin with the correct size in CHO-K1 cells. Immunofluorescence assay of lipopeptide transfection results shows that there is a significant difference of Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF) between cells post-transfected with recombinant proinsulin and cells post-transfected with non-recombinant plasmid pEGFP-N1. The result is consistent with previous IFA and WB testing of cells post-transfected with recombinant proinsulin using commercial lipofection agent TurboFect™. Therefore, proinsulin has been successfully expressed in CHO-K1 cells post-transfected with recombinant proinsulin using Pal-CK2H2-Tat(NLS)-TL(NLS)."

"Lipopeptida Pal-CKKHH-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV sebagai alternatif agen transfeksi nonviral yang baru telah berhasil disintesis dan diuji karakteristiknya. Penelitian dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui karakteristik lipopeptida Pal-CKKHH-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV dalam membentuk kompleks dengan DNA, mengondensasikan DNA, melindungi DNA dari degradasi enzim DNAse, serta mengetahui sitotoksisitas dan kemampuan transfeksinya pada galur sel mamalia, CHO-K1 dan HepG2. Karakteristik lipopeptida Pal-CKKHH-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV kemudian dibandingkan dengan karakteristik dua agen transfeksi komersil, yaitu Poly-L-Lysine dan Lipofectamine 2000. Hasil penelitian menunjukkan bahwa lipopeptida Pal-CKKHH-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV mampu membentuk kompleks dengan DNA pada rasio muatan 0,7, melindungi DNA dari degradasi DNAse pada rasio muatan 1,5, serta memiliki nilai IC50 sebesar 2,940 x 10-2 ?M pada sel CHO-K1 dan 1,964 x 10-2 ?M pada sel HepG2. Namun, lipopeptida tersebut kurang baik dalam mengondensasikan DNA dibandingkan Poly-L-Lysine dan Lipofectamine 2000. Berdasarkan hasil uji transfeksi, lipopeptida Pal-CKKHH-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV telah berhasil mentransfeksikan plasmid pCSII-EF-AcGFP ke dalam sel CHO-K1 dan HepG2. Keberhasilan tersebut ditandai dengan adanya pendaran hasil ekspresi Green Fluorescent Protein pada kedua sel. Meskipun demikian, pendaran yang dihasilkan dinilai kurang maksimal dibandingkan dengan hasil transfeksi oleh Lipofectamine 2000. Hasil transfeksi lipopeptida Pal-CKKHH-YGRKKRRQRRR-PKKKRKV yang optimal berada pada rasio muatan 7 dengan waktu inkubasi 48 jam.

---

Lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV as a novel nonviral transfection agent has been successfully synthesized and tested by its characteristics. The study aimed to determine the characteristics of lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV in forming complexes with DNA, condensing and protecting DNA from degradation of DNAse enzymes, as well as to reveal its cytotoxicity and ability as a transfection agent in mammalian cell lines, CHO K1 and HepG2. The characteristics of lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV were compared with the characteristics of two commercial transfection agents, Poly L Lysine and Lipofectamine 2000. The result has showed that lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV is able to complex DNA at charge ratio 0.7, protect DNA from DNAse degradation at charge ratio 1.5, and has an IC50 value of 2.940 x 10 2 M in CHO K1 and 1.964 x 10 2 M in HepG2 cells. However, the lipopeptide is not better in condensing the DNA than Poly L Lysine and Lipofectamine 2000. Furthermore, based on the transfection test result, lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV has successfully transfected pCSII EF AcGFP plasmids into CHO K1 and HepG2 cells. The accomplishment is depicted by presence of Green Fluorescent Protein expression in both cells. However, the fluorescence of transfection by lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV is not maximal, compare to Lipofectamine 2000. The optimal transfection result of lipopeptide Pal CKKHH YGRKKRRQRRR PKKKRKV is at charge ratio 7 and 48 hours incubation time."

"Pembuatan Stable Cell Line sendiri membutuhkan proses pengantaran materi genetik untuk mencapai tahap ekspresi gen rekombinan secara berkelanjutan. Metode ini menggunakan transfeksi untuk membantu mencapai tahapan tersebut. Badan Riset dan Inovasi Nasional (BRIN) Indonesia telah berhasil membuat konstruksi plasmid rekombinan pengekspresi protein Spike SARS-CoV-2. Namun, belum dilakukan penelitian lebih lanjut terkait penggunaan konstruksi plasmid rekombinan tersebut. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk memvalidasi ekspresi protein rekombinan dari plasmid rekombinan pengekspresi Spike SARS-CoV-2 yang akan digunakan dalam pembuatan Stable Cell Line pada galur sel mamalia 293T. Validasi ekspresi dari empat protein SARS-CoV-2 (Spike Full, Subunit S1, Subunit S2, dan Receptor Binding Domain) dilakukan melalui metode Immunofluorescence Assay (IFA) dan Western Blot (WB). Hasil menunjukkan bahwa dari empat ragam protein (Spike Full, Subunit S1, Subunit S2, dan Receptor Binding Domain) terbukti fungsional secara ekspresi dan sesuai dengan ukuran protein yang sesuai. Uji IFA menunjukkan bahwa terdapat dua nilai rata-rata Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF) yang unggul yaitu pada protein Spike Full dan Subunit S2 (118.813 dan 264.159 CTCF) sel pasca transfeksi yang menandakan bahwa terdapat perbedaan kemampuan ekspresi dari masing-masing protein. Uji western blot telah membuktikan dua protein (Spike Full dan Subunit S2) memiliki ukuran molekul yang sesuai (142,5 dan 66,0 kDa). Sehingga, dapat disimpulkan bahwa plasmid rekombinan yang dikonstruksi oleh BRIN terbukti fungsional dan dapat dilanjutkan ke dalam penggunaannya untuk pembuatan Stable Cell Line.

---

Making a Stable Cell Line requires a process of delivering genetic material to reach the continuous recombinant gene expression stage. This method uses transfection to help achieve this stage. The National Research and Innovation Agency of Indonesia (BRIN) has successfully constructed a recombinant plasmid expressing the SARS-CoV-2 Spike protein. However, no further research has been carried out regarding using these recombinant plasmid constructs. Therefore, this study aimed to validate the expression of recombinant proteins from the SARS-CoV-2 Spike-expressing recombinant plasmid to manufacture Stable Cell Line in mammalian cell line 293T. Validation of the expression of four SARS-CoV-2 proteins (Spike Full, Subunit S1, Subunit S2, and Receptor Binding Domain) was carried out using Immunofluorescence Assay (IFA) and Western Blot (WB) methods. The results showed that the four protein variants (Spike Full, S1 Subunit, S2 Subunit, and Receptor Binding Domain) were functional in expression and according to the appropriate protein size. The IFA test showed two superior Corrected Total Cell Fluorescence (CTCF) values: the Spike Full protein and the S2 Subunit (118.813 and 264159 CTCF) of post-transfection cells, which indicated that there were differences in the expression ability of each protein. The Western Blot test has proven that two proteins (Spike Full and Subunit S2) have the appropriate molecular size (142.5 and 66.0 kDa). Thus, it can be concluded that the recombinant plasmid constructed by BRIN is proven to be functional and can be used to manufacture Stable Cell Lines."

"Pendahuluan: Barier alamiah berupa membrane sel, kompartemen endosom, dan membrane inti sel yang menghalangi DNA ekstraseluler untuk mencapai target kerja dalam inti sel dalam mengawali proses pembentukan protein transgen. Sistem penghantar DNA, dalam hal ini protein penghantar DNA (PPD) dikembangkan untuk menghindari penghalang seluler tersebut. Karena sel tubuh berada dalam keadaan tidak membelah, maka diharapkan PPD tersebut dapat berfungsi pada sel tidak membelah. Metodologi: Metodologi yang dipakai adalah telaah literature, pengkloningan, dan uji in vitro. Dilakukan telaah literature untuk mencari peptida yang memiliki 1) kemampuan untuk masuk ke dalam sel/ berfusi dengan membran sel hospes, 2) kemampuan mengikat DNA, 3) kemampuan menghantarkan DNA melalui nuclear localization signal (NLS). Sekuen protein diubah menjadi DNA dengan menggunakan perangkat lunak. Setelah menjadi fragmen DNA, maka langkah selanjutnya DNA di klon ke dalam plasmid pQE80L untuk menghasilkan plasmid rekombian pengekspresi PPD. PPD diperoleh dengan cara mengekspresikannya ke dalam sistem prokariota. Setelah PPD dimurnikan, dilakukan uji fungsi kemampuan PPD menghantarkan DNA pada sel kultur membelah dan tidak membelah. Hasil: Berdasarkan telaah literature dihasilkan 5 rancangan PPD ALMR, SIMR, VPMR, THB2 dan THB4. Studi bioinformatika menunjukkan THB4 tidak dapat mengikat DNA dan bergerak ke inti sel. Proses pengkloningan menghasilkan 4 klon dan salah satu dari 4 kandidat PPD, THB2, tidak dapat diekspresikan dalam prokariota. ALMR, SIMR dan VPMR memiliki kemampuan untuk mengikat DNA dan melindungi DNA dari efek nuclease. Uji in vitro menunjukkan hanya ALMR yang dapat menghantarkan pcDNA3.1eGFP ke inti yang ditandai oleh ekspresi transgen oleh CHOK1. Jika dibandingkan dengan Lipofectamine, efektivitas penghantaran DNA oleh ALMR pada sel membelah kurang efektif,namun penghantaran DNA oleh ALMR pada sel tidak membelah lebih efektif dibandingkan Lipofectamine. Penambahan ALMR ke dalam komplek Lipofectamine:DNA dapat meningkatkan efisiensi penghantaran DNA dan viabilitas sel. Kesimpulan: PPD yang dapat mengikat, melindungi, dan menghantarkan DNA ke dalam sel membelah dan tidak membelah telah berhasil diperoleh. Penggabungan PPD dengan lipofectamine dapat meningkatkan efisiensi dan efektivitas penghantaran DNA kedalam sel tidak membelah serta meningkatkan viabilitas sel tidak membelah pasca transfeksi.

---

Background: The journey of extracellular DNA to reach its active site, nucleus, is dependent on its capability to overcome cellular barriers such as cell membrane, endosomal compartment and nuclear membran. To overcome such natural barriers, we developed peptide-mediated DNA delivery system that could deliver DNA especially into non-dividing cells as the majority of human cells are found in nondividing state.

Methodology: Based on literature studies we found peptides that have capability 1) to translocate/fuse with cellular membrane, 2) to bind DNA and protect DNA from nuclease 3) as nuclear localization signal (NLS). We convert peptides into DNA sequences by using software. DNA coding peptide-mediated DNA delivery systems were synthesized by commercially and manually using conventional PCR. The DNA fragments were cloned into prokaryote-expression systems. After expression and purification, peptide-mediated DNA delivery systems were tested their capability to increase the efficiency and effectiveness of the transformation of extracellular DNA in dividing and non-dividing cells.

Result: We constructs 5 candidates of peptide-mediated delivery system. One of them has no capability to bind DNA and located using nucleus. One of the rest peptidemediated delivery system could not be expressed in prokaryote system. Furthermore, three candidates have capability to binds DNA and protect DNA from nuclease degradation. Based on in vitro study, only one candidate has the capability to deliver DNA pcDNA3.1 eGFP into CHOK1 nucleus that marked by the expression of transgen. Compared to the Lipofectamine, a commercial delivery system, the capability of ALMR to deliver DNA into dividing cell is less efficient, but the capability of ALMR to deliver DNA into non-dividing cells is more efficient compare to Lipofectamine. The addition of ALMR into lipofectamine-DNA complex could increasing both the percentage of transgeneexpressing cells and viability of cell.

Conclusions: We have gained one peptide-mediated delivery system that could bind, protect and deliver DNA from extracellular into intracellular environment of dividing and non dividing cells. The addition of peptide-mediated delivery into Lipofectamine could increase the efectivity of DNA transformation and increase the cell viability."

"Agen pembawa materi genetik atau vektor berperan penting dalam mekanisme penghantaran gen. Vektor non-viral seperti liposom merupakan alternatif yang menjanjikan karena memiliki imunogenisitas yang lebih rendah daripada vektor viral. Namun, instabilitas dan rendahnya ekspresi gen merupakan tantangan utama dari penghantaran gen menggunakan vektor non-viral. Penggunaan polimer kationik polietilenimin (PEI) dengan berat molekul tinggi seperti PEI-25.000 efektif dalam menghasilkan ekspresi gen yang tinggi, tapi bersifat toksik terhadap sel. Maka dari ituOleh karena itu, formulasi liposom berbasis PEI yang memiliki berat molekul rendah diperlukan untuk meningkatkan efektivitasnya sebagai agen transfeksi. Pada penelitian ini, digunakan PEI bercabang dengan berat molekul 800 Da (PEI-800) yang diformulasikan dengan kolesterol dan Tween menjadi liposom dengan PEI-800 dan PEI-25.000 sebagai kontrol pembanding. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan kompleks DNA-liposom berbasis PEI-800 dan kolesterol (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4) dalam mengkondensasi dan melindungi materi genetik dari degradasi enzim, efektivitas liposom sebagai agen transfeksi pada galur sel Human Embryonic Kidney (HEK-293T), dan toksisitas liposom terhadap galur sel HEK-293T. Liposom dipreparasikan dengan metode dispersi etanol dan kompleks DNA-liposom dikarakterisasi secara lebih lanjut untuk mengetahui mobilitas, stabilitasnya terhadap degradasi enzim, dan kemampuannya mengkondensasi DNA. Liposom juga dievaluasi secara in vitro dengan uji MTT untuk mengetahui tingkat sitotoksisitasnya dan digunakan untuk transfeksi gen pengode Green Fluorescence Protein (GFP) pada galur sel HEK-293T untuk mengetahui efektivitas transfeksinya. Kompleks DNA-liposom dengan perbandingan 1:2 sampai 1:4 terhadap DNA mampu mengkondensasi DNA dan melindungi DNA dari degradasi enzim DNAse secara sempurna sehingga tidak terbentuk pita DNA pada gel elektroforesis. Liposom yang diformulasikan tidak mampu mengekspresikan GFP dengan baik pada galur sel HEK-293T, tapi bersifat non-toksik, yaitu menunjukkan ≥70% viabilitas sel. Liposom berbasis polimer kationik PEI-800 yang diformulasikan dengan kandungan kolesterol yang tinggi (10 µmol) dan Tween lebih efektif dalam mengkondensasi DNA dibandingkan kontrol. Karakterisasi kompleks DNA-liposom perlu dilakukan lebih lanjut dengan menentukan ukuran partikel dan zeta potensial. Evaluasi secara in vitro kompleks DNA-liposom juga perlu dilakukan pada galur sel mamalia lain dan secara in vivo untuk mengetahui efektivitasnya.

---

Gene delivery vehicles or vectors play a very important role in the mechanism of delivery. Non-viral vectors such as liposomes are promising alternatives to viral vectors because they are less imunogenic. However, instability and low expression are the major challenges in gene delivery using non-viral vectors. The use of cationic polymer polyethyleneimine (PEI) with high molecular weight like PEI-25.000 is effective in resulting high gene expression, but is toxic to the cells. Therefore, formulations of cationic polymer PEI with low molecular weight are needed to increase the efficiency. In this study, branched polyethyleneimine with molecular weight of 800 Da (PEI-800) that is formulated with cholesterol and Tween as cationic polymer based liposome, and PEI-800, PEI-2500 is used to as controls. This study aims to understand the ability of PEI-800 and cholesterol-based liposome complexes with DNA (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4) in condensing and protecting genetic materials from enzyme degradation, efficiency of liposomes as transfection agents in Human Embryonic Kidney (HEK-293T) cell lines, and the toxicity of liposomes to HEK-293T cell lines. Liposomes were prepared using ethanol dispersion method and DNA-liposomes complexes were further characterized for their mobility, stability against enzyme degradation, and the ability to condense DNA. Liposomes are also evaluated in vitro for the cytotoxicity using MTT assay and are used to transfect Green Fluorescent Protein (GFP) encoding gene to HEK-293T cell lines to know their transfection efficiency. DNA-liposomes complexes with 1:2 to 1:4 ratio were able to condense DNA and protect DNA against the degradation of DNAse effectively. Although DNA-liposomes complexes resulted in low expression of GFP in HEK-293T cell lines, liposomes were non-toxic, showing ≥70% cell viability. Liposomes with higher cholesterol content (10 µmol) and presence of Tween are more effective in condensing DNA than controls. Further characterization of DNA-liposome complexes’, particle size and zeta potential for instance is needed. In vitro evaluation in other mammalian cell lines and in vivo evaluation are needed to further determine the efficiency of low molecular weight PEI based liposomes."

"Zika virus (ZIKV) adalah flavivirus yang ditularkan melalui gigitan nyamuk Aedes yang biasanya hanya menyebabkan gejala demam ringan pada orang dewasa yang sehat, tetapi membawa risiko cacat lahir yang tinggi pada fetus jika terinfeksi selama kehamilan. ZIKV bisa bermutasi dan kemungkinan untuk menyebar ke area baru. Dengan belum adanya vaksin Zika yang disetujui, bahan alam seperti xanthone yang didapatkan dari ekstrak dari tanaman seperti manggis merupakan salah satu agen antivirus yang menjanjikan. Studi ini mengkarakterisasi infektifitas strain ZIKV Indonesia, kemudian meneliti efek antivirus alpha-mangostin (a-M), sejenis xanthone yang diekstraksi dari kulit buah manggis, terhadap ZIKV dalam tiga skenario perlakuan. Infeksi dan pertumbuhan ZIKV di galur sel secara signifikan berbeda antar sel dan dari waktu ke waktu (two-way ANOVA p < 0,01 di semua assay) dan bereplikasi dengan baik di galur sel A549 dan ginjal, tetapi tidak pada galur sel HepG2 atau sel darah putih. a-M secara efektif mengurangi titer virus dalam skenario full- dan post-treatment dengan selektivitas yang baik (SI = 6,14, 3,31, masing-masing), tetapi kurang efektif dalam mengurangi protein virus intraseluler (SI = 2,21, 1,78, masing-masing), dengan ribavirin (sebagai control) menunjukkan lebih sedikit efek, tetapi selektivitas yang lebih baik di semua skenario. Molecular docking menunjukkan a-M mengikat dengan baik ke kantung protein yang relevan pada protein replikasi ZIKV: NS1, NS3-helicase dan RdRp. Studi ini menyimpulkan bahwa ZIKV Indonesia mempunyai sifat yang mirip dengan strain lain di dunia dan a-M adalah antivirus ZIKV yang menjanjikan dengan toksisitas yang relatif rendah, dan bekerja dengan menghambat replikasi ZIKV, namun masih perlu dikonfirmasi dengan penelitian lebih lanjut.

---

Zika virus (ZIKV) is a flavivirus transmitted by the bite of Aedes mosquitoes which usually causes only mild fever symptoms in healthy adults, but carries a high risk of birth defects in fetuses if infected during pregnancy. ZIKV has a history of mutations and is likely to spread to new areas. With no approved vaccine, xanthones in extracts from plants such as mangosteen represent promising antiviral agents. This study first characterized the infection patterns of the Indonesian ZIKV strain, then investigated antiviral effects of alpha-mangostin (a-M), a xanthone extracted from mangosteen pericarp, against it in three treatment scenarios. ZIKV infection progressed significantly differently between cells and over time (two-way ANOVA p < 0.01 in all assays) and replicated well in A549 and kidney cell lines, but not HepG2 or white blood cell lines. a-M effectively reduced viral titer in A549 in full and post treatment scenarios with good selectivity (SI = 6.14, 3.31, respectively), but was less effective in reducing intracellular viral protein (SI = 2.21, 1.78, respectively), with ribavirin showing less effect, but better selectivity in all scenarios. Molecular docking showed a-M binding well to pockets of interest on the ZIKV replication proteins NS1, NS3-helicase and RdRp. This study concludes that Indonesian ZIKV is similar to other strains in terms of cell line infectivity and a-M is a promising antiviral agent with relatively low toxicity, and works by inhibiting ZIKV replication, which should be confirmed with further research."

"ABSTRAKHuman papillomavirus HPV adalah virus DNA yang dapat menginfeksi bagian basal sel epitel leher rahim wanita melalui luka sehingga meningkatkan kasus kanker serviks di Indonesia. Penelitian mengenai pengembangan obat terhadap penyakit kanker serviks berbasis vaksin DNA terapeutik telah dilakukan melalui konstruksi plasmid rekombinan antigen E7 HPV-16 pada sistem ekspresi mamalia. Vektor plasmid pcDNA 3.1 5.428 pb yang digunakan pada penelitian berhasil dikonstruksi melalui proses digesti pada situs NheI dan ligasi dengan fragmen acak gen E7 294 pb sehingga membentuk plasmid rekombinan pcDNA-E7 CADB. Plasmid rekombinan hasil ligasi diklona ke dalam sel E. coli TOP 10 melalui proses transformasi heat shock. Analisis hasil penelitian menunjukkan bahwa 5 koloni mengandung plasmid rekombinan pcDNA-E7 CADB. Analisis orientasi arah gen melalui PCR dan digesti pada 5 koloni menghasilkan 2 koloni plasmid positif dengan arah orientasi 5 rsquo; ke 3 rsquo; pada koloni nomor 5 dan 7. Kedua koloni menunjukkan bahwa fragmen gen E7 CADB berhasil disisipkan pada vektor pcDNA 3.1 dan berhasil diklona ke dalam E. coli TOP 10.

---

ABSTRACTHuman papillomavirus HPV is a DNA virus that can infects the basal cells of the female cervix through wounds in which it may increase the risk of cervical cancer in Indonesia. There has been a drug development research to treat cervical cancer based on therapeutic DNA vaccine via constructing recombinant plasmid of HPV 16 E7 in mammalian expression system. pcDNA 3.1 plasmid vectors 5.428 bp which were used in this research are successfully construced through the digestion process at NheI site and the ligation process with shuffling fragments of E7 gene 294 bp which created pcDNA E7 CADB recombinant plasmid. Recombinant plasmid which is the result of the ligation process is cloned into TOP 10 Escherichia coli cell through a transformation process called heat shock. The result of this research displays 5 colonies containing pcDNA E7 CADB recombinant plasmid. Analysis of gene direction orientation through PCR and digestion of 5 colonies displays positive plasmid on 2 colonies with 5 rsquo ndash 3 rsquo direction on colony unit 5 and colony unit 7. Result of the 2 colony shows that E7 CADB gene fragment successfully inserted into the NheI site of pcDNA 3.1. It also resulted in cloning completion of E7 CADB gene fragments into TOP 10 E. coli."

"ABSTRAKPenyakit Hepatitis C yang disebabkan oleh virus Hepatitis C HCV telah menjadi masalah kesehatan serius di banyak Negara. Beberapa studi menunjukkan bahwa komponen utama reaksi imun protektif terhadap HCV adalah respon yang tinggi dari sel T CD 8 dan CD 4 terhadap bagian target dari HCV yang berikatan dengan MHC kelas I dan II yang dipresentasikan kepada sel T. Untuk reaksi imun protektif dibutuhkan respon sel T yang menghasilkan sitokin yang tepat dan memperbanyak diri dengan baik. Untuk mengatasi problem keberagaman dari HCV, maka dirancanglah konstruk yang relatif conserve. Protein core hingga saat ini merupakan bagian paling conserve dari HCV yang dapat menimbulkan reaksi sel T CD 8 bila dapat berikatan dengan MHC kelas I. Dalam penelitian ini dirancang gen pengkode protein CoreE1E2 menggunakan DNA sintetik untuk dikonstruk sebagai kandidat vaksin DNA menggunakan plasmid ekspresi mamalia pCI. Ekspresi protein tersebut dilakukan pada cell line manusia Hep2. Konstruksi pCI-Core-E1-E2 mampu mengekspresikan protein Core-E1-E2 pada sel Hep2 dengan tingkat ekspresi tertinggi pada 48 jam.

---

ABSTRACTHepatitis C is a contagious liver disease that results from infection with hepatitis C virus HCV which now have became serious health problem in many countries. There was evidence that the main component of protective immunity against HCV are the high response from both CD 8 T cells and CD 4 T cells against part HCV target which binds with MHC class I and II that will be presented to T cells. T cells have to face HCV diversity problems, but they also could target the internal part of the virus which relatively more conserve. For a protective immune response, T cell response to produce cytokines and could proliferate was needed. With this reason, a construct was made which has a conserve region of HCV that could trigger CD 8 T cell reaction with DNA Vaccine technique. Until now, Core Protein is the most conserve part from HCV which could trigger the CD 8 T cell reaction when it bound with MHC I. HCV protein CoreE1E2 coding gene was designed in this research using synthetic DNA to be constructed into mammalian expression plasmid pCI as a DNA vaccine candidate. pCI Core E1 E2 construct can express Core E1 E2 protein in Hep2 cell line with the highest expression rate in 48th hour."

"ABSTRAKSaat ini terdapat banyak sekali studi yang sedang berjalan tentang sel punca pluripoten dan potensinya untuk menjadi terapi regeneratif pada masa yang akan datang. Sampai sekarang, sel punca embrionik adalah satu-satunya sumber untuk sel punca pluripoten yang telah dipelajari dengan baik. Akan tetapi, banyak sekali tantangan untuk memakai sel punca embrionik ini seperti masalah etik dan penolakan sistem imun tubuh. Belakangan ini, banyak sekali studi yang sedang berjalan dalam menginvestigasi cara baru dalam pemograman ulang reprogramming sel manusia untuk menjadi induced pluripotent stem cell iPSC . OCT4 Octamer-binding faktor transkripsi 4 adalah salah satu protein krusial yang bertanggung jawab atas pembaharuan self-renewal sel punca embrionik. Maka dari itu, studi ini bertujuan untuk menginvestigasi kemampuan OCT4, dengan bantuan VP22 viral protein , untuk dilokalisasi ke dalam sel manusia dewasa HepG2 , yang akhirnya dapat membuat pemograman ulang sel HepG2 menjadi iPSC. Pada penelitian ini, sel HepG2 diinkubasi dengan protein fusi rekombinan VP22-OCT4 selama 1 jam dan 6 jam. Kemudian, proses indirect immunofluorescence staining dilaksanakan yang mencakup inkubasi dengan mouse monoklonal IgG antibodi primer terhadap OCT4 Ab1 dan dilanjutkan dengan goat anti-mouse IgG antibodi sekunder, FITC konjugat Ab2 . Pengamatan dengan mikroskop confocal dilaksanakan untuk melihat adanya imunofluoresen. Pada hasil yang diperoleh, terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok eksperimen untuk kedua periode inkubasi p=0.005 untuk 1 jam dan p=0,000 untuk 6 jam , serta perbedaan bermakna juga terjadi antara kelompok sel HepG2 dengan VP22-OCT4 diinkubasi selama 1 jam dan 6 jam p=0,044 . Untuk menyimpulkan hasil tersebut, protein rekombinan VP22-OCT4 dapat dilokalisasi ke dalam sel HepG2 dalam waktu inkubasi selama 1 jam dan 6 jam.

---

ABSTRACTThere are many studies ongoing about the remarkable potential of pluripotent stem cell as the future regenerative therapy. Embryonic stem cell is the only source that has been studied well for it. However, many constraints arise regarding this matter like ethical problems and risk of cell transplantation rejection. Recently, there are many research undergone in exploring new approach through reprogramming somatic cell to become induced pluripotent stem cell iPSC . OCT4 Octamer binding transcription factor 4 is one of the proteins that is responsible for the self renewal of embryonic stem cell. Therefore, this study aimed to investigate the ability of OCT4 transcription factor, with the help of VP22 viral protein , to be localized into adult somatic cells HepG2 , which in turn could reprogram it into iPSC. In this study, HepG2 cells are isolated with VP22 OCT4 recombinant fusion protein for 1 hour and 6 hours, which then followed by isolating with mouse monoclonal IgG primary antibody against OCT4 Ab1 and goat anti mouse IgG secondary antibody, FITC conjugate Ab2 respectively for the indirect immunofluorescence staining function. Confocal microscope is utilized to observe the presence of immunofluorescence. The result of the experiment showed a significant difference between the control and the experimental groups for both incubation period p 0.005 for 1 hour and p 0.000 for 6 hours . Moreover, there is also a significance difference between the group of HepG2 cells with VP22 OCT4 incubated for 1 hour and 6 hours p 0.044 . In conclusion, VP22 OCT4 recombinant protein can be translocated inside the HepG2 cells under 1 hour and 6 hours of incubation periods."

"Kejadian AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) yang disebabkan Human Immunodeficiency Virus tipe 1 (HIV-1) terus meningkat setiap tahunnya. Pencegahan penularan virus HIV-1 masih sulit karena belum ada vaksin yang telah ditemukan untuk mencegah penularan atau transmisi virus ini. Selain itu, faktor lainnya adalah jarangnya diagnostik yang tersedia untuk awal infeksi, serta variasi genetik virus HIV-1 yang meningkat dengan cepat. Penelitian bertujuan untuk mengembangkan virus dengan menggunakan klona galur sel T CD4 yaitu CEM-GFP dengan virus HIV-1 CRF01_AE untuk mendapatkan virus dengan sifat genetik yang relatif homogen dan sifat virus yang sama. Ekspresi virus dalam sel target dimonitor melalui induksi green fluorescent protein yang akan diekspresikan oleh CEM-GFP ketika sel ini terinfeksi oleh virus HIV-1. Infeksi dilakukan dengan dua metode yaitu direct cell to cell transmission dan cell-free virus infection, hasil infeksi kedua metode ini dibandingkan fluoresensinya dengan mikroskop fluoresensi dan pengukuran ekspresi GFP dengan sitometer.Setelah 7 hari kultur, pengamatan dengan mikroskop fluoresensi menunjukkan bahwa sel terinfeksi dengan metode direct cell to cell transmission lebih banyak dibandingkan dengan cell-free virus infection. Pengukuran ekspresi GFP dengan sitometer pun menunjukkan hal serupa dimana ekspresi GFP sel terinfeksi dengan metode direct cell to cell transmission lebih banyak dibanding dengan cell-free virus infection. Untuk melihat apakah virus berhasil dikeluarkan dari sel terinfeksi dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction. Hasil menunjukkan bahwa virus telah berhasil terdeteksi pada supernatan kultur sel CEM-GFP terinfeksi virus HIV-1.

---

The incidents of AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) that caused by Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) are increasing every year. The prevention of HIV transmission is still difficult to be done because HIV vaccine has not been found yet. Besides, another factor in HIV therapy is the rare early diagnostic available and the genetic variation of HIV-1 virus that increased rapidly. This study was aimed for propagating virus by using CEM-GFP clones, the derivative of CD4 T cells infected with CRF01_AE for obtaining virus with relatively homogen genetic variation and possessing the same characteristic. The virus expression in the target cell was observed by the induction of green fluorescent protein expressed by CEM-GFP when this cell was infected by HIV-Virus. The infection was held by two methods, cell-to-cell transmission and cellfree virus infection, the fluorescent of infected cell of this two methods was compared with fluorescent microscope and GFP expression assay with cytometer.

Within 7 days of culture, observation with fluorescent microscope showed that the infected cells of direct cell-to-cell transmission method was higher than the cellfree virus infection. GFP expression assay also showed the same result. The GFP expression of infected cells with direct cell-to-cell transmission was higher than cell-free virus infection. To investigate whether the virus was released from the infected cells, Polymerase Chain Reaction, were applied in this study. The result showed that the cell-free virus can be detected in culture supernatant of CEMGFP cells infected with HIV-1."