Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"ABSTRAKProtein Voltage dependent anion channel 3 (VDAC3) merupakan salah satu kandidat antigen untuk pengembangan metode imunokontrasepsi pada pria. Penelitian bertujuan membuat konstruksi vektor rekombinan gen VDAC3 pada vektor pET100/D-TOPO melalui metode directional TOPO® cloning. Fragmen gen VDAC3 target berukuran 600 bp diamplifikasi dari cDNA yang berasal dari mRNA sel sperma manusia dengan primer spesifik gen VDAC3 ekson 6--10. Gen VDAC3 target disisipi sekuens CACC pada ujung 5? untuk ligasi pada vector menggunakan topoisomerase I. Vektor rekombinan hasil transformasi dengan metode kejutan panas pada sel E. coli TOP10 diseleksi menggunakan medium ampisilin. Analisis transforman dengan PCR colony menggunakan primer gen VDAC3 rekombinan menghasilkan pita DNA berukuran 607 bp. Hasil penelitian menunjukkan gen VDAC3 telah berhasil dikonstruksi ke dalam plasmid pET100/D-TOPO.

---

ABSTRACTVoltage-dependent anion channel 3 (VDAC3) protein is one of antigen candidate for the development of methods immunecontraception in males. The research aims to create a recombinant gene vector construction of VDAC3 gene on pET100/D-TOPO vector via directional TOPO® cloning method. VDAC3 target gene fragment size 600 bp was amplified from cDNA derived from mRNA of human sperm cells with the gene specific primers VDAC3 exons 6--10. VDAC3 target gene inserted at the end of the 5? CACC sequence for ligation to the vector using topoisomerase I. Recombinant vector which is transformed by heat shock on the cell E. coli TOP10 selected using ampicillin medium. Analysis of transformants by colony PCR using the primers VDAC3 recombinant gene produced 607 bp DNA band size. The results of the study showed VDAC3 gene has been successfully constructed into the plasmid pET100/D-TOPO."

"ABSTRAKEpidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) adalah salah satu varian mutan dari protein human EGFR. Mutasi yang terjadi pada EGFR menyebabkan terjadinya kanker. Berbagai mutan EGFR, termasuk EGFRvIII, telah banyak dipelajari karena potensinya sebagai molekul target dalam terapi kanker. Gen penyandi domain ekstraselular EGFRvIII telah berhasil dikonstruksi pada penelitian sebelumnya untuk studi ekspresi protein sebagai molekul target dalam terapi kanker. Penelitian bertujuan untuk subkloning gen EGFRvIII ke dalam plasmid ekspresi pPICZ? dan transformasi plasmid rekombinan ke dalam sel Pichia patoris SMD1168H. Fragmen gen EGFRvIII diperoleh melalui amplifikasi secara in vitro dengan teknik PCR plasmid pJ404-EGFFRvIII-bfp. Gen EGFRvIII tersebut telah terfusi dengan gen bfp penyandi blue fluorescent protein BFP pada ujung-C. Fusi gen tersebut disubklon ke dalam plasmid pPICZ? pada situs XhoI untuk memperoleh plasmid pPICZa-EGFRvIII-bfp . Plasmid rekombinan ditransformasikan ke dalam sel E. coli TOP10 F rsquo; dengan metode kejut panas. Plasmid rekombinan diseleksi dan dikarakterisasi dengan analisis PCR dan sequencing. Plasmid yang telah dikonfirmasi susunan basa dan ukurannya ditransformasikan ke dalam sel P. pastoris SMD1168H dengan metode elektroporasi untuk ekspresi protein rekombinan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fusi gen EGFRvIII-bfp 1317 bp telah berhasil disubklon ke dalam plasmid pPICZ? dan plasmid rekombinan pPICZ?-EGFRvIII-bfp berhasil ditransformasikan ke dalam P. patoris SMD1168H dengan efisiensi transformasi sebesar 90 CFU/ g DNA plasmid.

---

ABSTRACTEpidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII is one of the mutant variant of the EGFR protein. Mutations that occur in EGFR cause cancer. Various mutants of EGFR, including the mutant variant III have been widely studied because of their potential as target molecules in cancer therapy. The extracellular domain coding EGFRvIII gene has been successfully constructed in previous studies for the study of protein expression as a molecule target in cancer therapy. The objective of research are to subclone the EGFRvIII gene into the pPICZ expression plasmid then recombinant plasmid transformation into Pichia patoris SMD1168H cells. Epidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII gene fragment was obtained with in vitro amplification by PCR of pJ404 EGFFRvIII bfp plasmid. Epidermal growth factor receptor variant III EGFRvIII gene has been fused with the bfp gene encoding blue fluorescent protein BFP at the C end. The gene fusion was subcloned into the pPICZ at the XhoI site to obtain the pPICZa EGFRvIII bfp plasmid. Recombinant plasmid was transformed into E. coli TOP10 F 39 cells by heat shock method. Recombinant plasmids were selected and characterized by PCR analysis and sequencing. The confirmed plasmid of the base structure and size is transformed into the P. pastoris SMD1168H cell by an electroporation method for the expression of the recombinant protein. Results showed that the fusion of the EGFRvIII bfp 1317 bp gene was successfully subcloned into the pPICZ and the recombinant plasmid pPICZ EGFRvIII bfp was successfully transformed into P. patoris SMD1168H with a transformation efficiency of 90 CFU g DNA plasmid."

"Gen Epidermal Growth Factor Receptor Varian III (EGFRvIII) merupakan mutan dari gen EGFR yang terbentuk akibat mutasi delesi ekson 2 sampai 7. Gen EGFRvIII mengkode ekspresi protein EGFRvIII yang hanya diekspresikan pada sel kanker, sehingga protein ini berpotensi untuk digunakan sebagai molekul target dalam terapi kanker yang ditargetkan. dengan antibodi monoklonal. Fragmen anti-EGFRvIII untai tunggal (scFv) adalah antibodi monoklonal yang secara khusus mengenali epitop unik EGFRvIII. Antibodi ini perlu diuji aktivitasnya dengan protein EGFRvIII. Protein EGFRvIII dapat diproduksi dengan menggunakan plasmid pPICZα-EGFRvIII-bfp. pPICZα-EGFRvIII-bfp adalah plasmid rekombinan dengan promotor AOX1 yang tidak dapat digunakan, yang dirancang untuk diubah menjadi P. pastoris sehingga protein EGFRvIII dapat diekspresikan secara ekstraseluler. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan klon P. pastoris transforman yang mengandung gen EGFRvIII dan dapat mengekspresikan protein EGFRvIII. Metode transformasi yang digunakan adalah elektroporasi. Seleksi P. pastoris transforman dilakukan dengan antibiotik zeosin. Gen target pada transforman diverifikasi menggunakan PCR koloni. Ekspresi protein target dilakukan dengan menggunakan teknik induksi metanol. Ekspresi protein dilihat di bawah mikroskop fluoresensi dan dianalisis dengan SDS-PAGE. Hasil penelitian menunjukkan klon P. pastoris transforman yang mengandung gen EGFRvIII-bfp (750 bp) berhasil diperoleh, dengan efisiensi transformasi plasmid 0,003 x 103 cfu/μg. Protein EGFRvIII berhasil diekspresikan berdasarkan pendaran biru protein BFP, tetapi diduga mengalami glikosilasi dan masih menyatu dengan sinyal sekresi karena ukuran protein SDS-PAGE (sekitar ~ 66,2 kDa dan ~ 116 kDa) lebih besar dari ukuran target (~ 41,9 kDa).

---

Epidermal Growth Factor Receptor Variant III (EGFRvIII) gene is a mutant of the EGFR gene which is formed as a result of deletion mutations of exons 2 to 7. The EGFRvIII gene encodes the expression of the EGFRvIII protein which is only expressed in cancer cells, so that this protein has the potential to be used as a target molecule in cancer therapy. targeted. with monoclonal antibodies. The single-stranded anti-EGFRvIII (scFv) fragment is a monoclonal antibody that specifically recognizes the unique epitope of EGFRvIII. These antibodies need to be tested for their activity with the EGFRvIII protein. The EGFRvIII protein can be produced using the plasmid pPICZα-EGFRvIII-bfp. pPICZα-EGFRvIII-bfp is a recombinant plasmid with the unusable AOX1 promoter designed to be converted into P. pastoris so that the EGFRvIII protein can be expressed extracellularly. This study aims to obtain clones of P. pastoris transforman that contain the EGFRvIII gene and can express the EGFRvIII protein. The transformation method used is electroporation. P. pastoris transforman selection was carried out with zeosin antibiotics. The target genes in the transformants were verified using colony PCR. The target protein expression was carried out using methanol induction technique. Protein expression was viewed under a fluorescence microscope and analyzed by SDS-PAGE. The results showed that P. pastoris transforman clones containing the EGFRvIII-bfp (750 bp) gene were successfully obtained, with a plasmid transformation efficiency of 0.003 x 103 cfu/μg. EGFRvIII protein was successfully expressed based on the blue luminescence of BFP protein, but it was suspected to undergo glycosylation and still fuse with the secretion signal because the size of the SDS-PAGE protein (approximately ~ 66.2 kDa and ~ 116 kDa) was larger than the target size (~ 41.9 kDa) ."

"Sebagian besar bakteri asam laktat (BAL) menghasilkan eksopolisakarida (biopolimer fruktan) yang mempunyai banyak manfaat dalam industri makanan, kosmetik, kesehatan dan farmasi. Sintesis biopolimer ini melibatkan peran enzim fruktansukrase atau fruktosiltransferase (ftf). Rekayasa genetika dapat dilakukan untuk mendapatkan biopolimer yang berkriteria unggul, yaitu biopolimer inulin yang mempunyai derajat polimerisasi tinggi. Weissella confusa galur MBFCNC-2(1) telah menjadi sumber gen fruktansukrase yang dikloning lengkap di inang E. coli BL21 StarTM.Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan klon versi terpenggal dari gen fruktansukrase karena klon gen lengkap dilaporkan mempunyai masalah dalam ekspresinya. Sebagai template untuk kloning digunakan plasmid dari E. coli BL21 StarTM rekombinan, plasmid rekombinan pO_ftfNS pembawa gen lengkap, dan DNA genomik. PCR dilakukan menggunakan primer FTFdel_Fw dan FTFdel_Rv. Hasil PCR disekuensing dan dianalisis menggunakan BLAST. Sebagai hasil, gen fruktansukrase versi terpenggal didapatkan dari plasmid rekombinan pO_ftfNS pembawa gen ftf lengkap.

---

Most of Lactic Acid Bacteria (LAB) produce exopolysaccharide (fructan biopolymer) that has many advantages in food, cosmetic, health, and pharmacy industries. Synthesis of this biopolymer involves the role of fructansucrase enzyme of fructosyltransferase (ftf). Genetic engineering could be done to obtain biopolymer with excellence characteristcs, that is inulin with high degree of polymerization. Weisella confusa strain MBFCNC-2(1) has been used as a source of fructansucrase gene which is full-length clonned at E. coli BL21 StarTM.The aim of this study was to obtain truncated gene of fructansucrase because fulllength clone has problem on its expression. The PCR template used in this study were plasmid of Recombinant E coli BL21 StarTM, recombinant plasmid pO_ftfNS carrying full-length gene, and genomic DNA. PCR was carried out by FTFdel_Fw and FTFdel_Rv primer. The PCR product was sequenced and analyzed by using BLAST. Result revealed that truncated fructansucrase gene was obtained from plasmid recombinant pO_ftfNS carrying full-length gene."

"Many kinds of linear plasmids-like DNAs,in mitochondria have been reported in higher plants known,from the animal kingdom....."

"

Protein Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) memiliki peran spesifik dalam menstimulasi poliferasi dan pematangan sel neutrofil. Penelitian sebelumnya, gen CSF3 telah berhasil dikontruksi secara in vitro di dalam vektor pPICZα dengan penyisipan kodon metionin pada ujung-5’ dan kodon stop pada ujung-3’ dari gen CSF3. Kontruksi tersebut menghasilkan pPICZα-metCSF3. Tujuan penelitian ini adalah transformasi plasmid pPICZα-metCSF3 pada sel inang Komagataella phaffii dan melakukan pengujian fenotipe Mut pada sel transforman yang diperoleh. Plasmid pPICZα-metCSF3 diisolasi dari Escherichia coli DH5α dan dilinierisasi sehingga menghasilkan plasmid linier berukuran 4.131 pb. Plasmid rekombinan dipurifikasi dan dikuantifikasi, selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel inang K. phaffii dengan metode elektroporasi. Jumlah koloni yang terbentuk berkisar 214 koloni transforman dan nilai efisiesi transformasi mencapai 0,18 x 10³ cfu/µg plasmid DNA. Seleksi koloni transforman dilakukan pada medium YPD dengan konsentrasi zeosin yang bertingkat. Sebanyak 15 dari 23 koloni transfoman memiliki resistensi terhadap seluruh tingkatan konsentrasi zeosin. Pengujian fenotipe Mut pada 23 koloni transforman memiliki fenotipe Mut⁺. Berdasarkan data pengamatan yang diperoleh bahwa K. phaffii berhasil membawa plasmid pPICZα-metCSF3 dan koloni transforman memiliki keberadaan gen aktif AOX1 dan AOX2 (fenotipe Mut⁺).

---

Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) protein has a specific role to stimulate proliferation and maturation of neutrophils. Previous research has succeeded an in vitro construction of CSF3 gene on pPICZα vector, while inserting a methionine codon at 5’-end and two stop codons at 3’-end of CSF3 gene sequences. The metCSF3 gene has been formed in recombinant plasmid named pPICZα-metCSF3. The purposes of this research are to transform the pPICZα-metCSF3 recombinant plasmid into Komagataella phaffii host and conducting the phenotype Mut analysis on the transformant colonies. The pPICZα-metCSF3 plasmid was isolated from Escherichia coli DH5α and was linearized to 4.131 bp of plasmid in size. pPICZα-metCSF3 plasmid was purified and quantified, then it was transformed into K. phaffii through electroporation method. Approximately 214 transformant colonies successfully produced and the transformation efficiency reached up to 0,18 x 10³ cfu/µg of DNA plasmid. The transformant was selected on YPD medium with increasing zeocin concentration. Approximately 15 out of 23 transformant were resistant against all stage of zeocin concentration. The determination of Mut phenotype on 23 transformant colonies categorized as Mut⁺ phenotype. In brief, K. phaffii has been succeded to bring pPICZα-metCSF3 plasmid and transformant colonies have active AOX1 and AOX2 gene (Mut⁺ phenotype).

"

"

Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) telah ditemukan sebagai protein reseptor spesifik pada beberapa jenis sel kanker. Protein tersebut merupakan hasil ekspresi dari salah satu jenis mutan gen EGFR, yaitu gen EGFRvIII. Mutasi pada gen EGFRvIII terjadi karena adanya delesi ekson  2  hingga 7 yang merupakan bagian dari domain ekstraselular yang berinteraksi dengan ligan alaminya. Keberadaan EGFRvIII yang spesifik hanya pada sel kanker memberikan potensi bagi protein tersebut untuk dijadikan sebagai molekul target pada terapi penargetan kanker dengan antibodi monoklonal. Fragmen antibodi untai tunggal (ScFv) anti-EGFRvIII merupakan antibodi monoklonal yang dapat digunakan sebagai ligan spesifik terhadap EGFRvIII dalam simulasi terapi penargetan kanker. Antibodi ScFv-anti-EGFRvIII dapat diproduksi menggunakan plasmid pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp. Plasmid rekombinan ini memiliki promotor indusibel AOX1 dan sinyal sekresi matting factor-a yang dapat ditransformasikan pada Komagataella phaffii sehingga antibodi ScFv-anti-EGFRvIII dapat disekresikan oleh sel inang. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan klona K. phaffii transforman yang membawa gen ScFv-anti-EGFRvIII. Plasmid diisolasi dari Escherichia coli TOP10F` dan dipurifikasi dengan pelarut organik. Plasmid kemudian dipotong dengan enzim SacI sehingga diperoleh plasmid linear yang berukuran 5.150 bp. Metode transformasi yang digunakan adalah elektroporasi. Seleksi K. phaffii transforman dilakukan pada medium seleksi yang mengandung antibiotik zeocin. Hasil penelitian menunjukkan klona K. phaffii transforman yang mengandung plasmid rekombinan  pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp (5150 bp) berhasil diperoleh. Hasil seleksi K. phaffii transforman dengan replica platting menunjukkan, bahwa seluruh koloni tunggal transforman yang terpilih dapat tumbuh dengan baik pada konsentrasi zeocin 100 μg/mL. Hal tersebut mengindikasikan, bahwa plasmid rekombinan pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp dapat berintegrasi ke dalam genom K. phaffii secara stabil.

 

---

Cancer is a disease caused by abnormal proliferation of cell which can produce fatal effects for an organ system. Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) has been found to be a spesific receptor protein in several tyoes of cancer cells. The protein is expressed by one of many types of mutant from EGFR gene, namely EGFRvIII. Mutation in EGFRvIII gene occur because of deletion on exon 2 to exon 7 that are part of the extracellular domain that interacts with their natural ligand. The specificity of EGFRvIII on cancer cells EGFRvIII provides a potential for the protein to be used as target molecule in cancer-targeting therapy with monoclonal antibodies. Single-chain variable fragment (ScFv) of anti-EGFRvIII is a monoclonal antibody that can be used as specific ligands against EGFRvIII in simulating cancer-targeting theraphy. The ScFv-anti-EGFRvIII antibody can be produced using the pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp plasmid. This recombinant plasmid has an inducible AOX1 promoter and matting factor-a secretion signal that can be transformed into Komagataella phaffii so that the ScFv-anti-EGFRvIII antibody can be expressed extracellularly. The purpose of this study is to obtain a K. phaffii transformant clone that carries the ScFv-anti-EGFRvIII gene. The plasmid were isolated from Escherichia coli TOP10F` and purified. Plasmid were then cut with the SacI enzym so that a 5.150 bp linear plasmid was obtained. The method of transformation in this study is electroporation. The selection of K. phaffii transformant was carried out on a selection medium containing zeocin antibiotic. The results showed that K. phaffii transformant clone containing pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp (5150 bp) recombinant plasmid was succesfully obtained. The selection of K. phaffii transforman with replica platting shows that all selected single colony transformants can grow well at zeocin concentration of 100 μg/mL. The result indicate that the pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp recombinant plasmid can be integrated into K. phaffii genome stably.

 

"

"Penelitian karakterisasi produk gen sintetik lipase Thermomyces lanuginosus yang diekspresikan oleh Bacillus subtilis DB104 rekombinan K7 bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu, pH, dan ion logam terhadap aktivitas lipase. Bacillus subtilis DB104 promXynAQ1 non rekombinan digunakan sebagai kontrol. Lipase rekombinan optimal diproduksi pada media LB yang mengandung substrat minyak zaitun 1% selama 24 jam. Aktivitas lipase rekombinan diuji pada berbagai variasi perlakuan suhu (40°C--80°C), pH (5--10), dan penambahan ion logam menggunakan metode uji aktivitas spektrofotometri p-nitrofenil palmitat (pNPP assay). Data aktivitas spesifik lipase rekombinan dianalisis menggunakan data standar deviasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa lipase rekombinan aktif maksimal pada suhu 80°C dan optimal pH 8 dengan aktivitas spesifik sebesar 1,488 U/mg. Penambahan ion logam Ca2+, Mg2+, Cu2+, dan senyawa pengelat EDTA berpengaruh menghambat aktivitas enzim lipase rekombinan.

---

The research of characterization of lipase Thermomyces lanuginosus synthetic gene product expressed by recombinant Bacillus subtilis DB104 had been conducted to investigate the effects of temperature, pH, and metal ions toward the enzymatic activity. Non recombinant lipase of Bacillus subtilis DB104 promXynAQ1 was used as control. Recombinant lipase was optimally produced using LB media containing 1% olive oil during 24 hours incubation time. Recombinant lipase was assayed in various treatments of temperature (40°C--80°C), pH (5--10), and metal ion addition using spectrophotometric method of p-nitrophenyl palmitate assay (pNPP assay). Specific activity of recombinant lipase data were analyzed with deviation standard. Experiment results showed that activity of recombinant lipase is maximum at temperature 80°C and optimum at pH 8 in the amount of 1,488 U/mg. The presence of metal cations Ca2+, Mg2+, Cu2+, and chelating-agent EDTA gave an inhibitory effect on recombinant lipase activity."