Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Lipase merupakan salah satu enzim yang penting di industri enzim, dan banyak digunakan dalam pembuatan zat aditif makanan, kosmetik, dan industri farmasi. Penelitian sebelumnya yang dilakukan di PTB-Laptiab BPPT, pengklonaan gen sintetik T. lanuginosus lipase pada B. substilis memiliki aktivitas lipase yang rendah yaitu sebesar 1,488 U/mg. Penelitian ini bertujuan untuk mengklona gen sintetik T. lanuginosus lipase TLL ke dalam vektor ekspresi Pichia pastoris menggunakan sinyal peptida asli TTL. Gen TLL yang mengandung sinyal peptida asli diamplifikasi dengan PCR, dan disisipkan ke dalam pPICZ? A di antara situs XhoI dan XbaI, kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli DH5?. Hasil transformasi dipilih dua rekombinan positif untuk dilakukan analisis sekuensing. Hasil sekuensing, kedua rekombinan mengandung gen target lipase. Plasmid yang telah dikonfirmasi kemudian dilinearisasi dan ditransformasikan ke dalam P. pastoris X-33 dengan menggunakan metoda elektroporasi. Gen T. lanuginosus lipase berhasil diintegrasi ke dalam kromosom P. pastoris X-33, yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening pada media Yeast extract Peptone Dextrose Tributyrin YPD.TB agar yang mengandung zeocin. Thermomyces lanuginosus lipase memiliki daerah open reading frame ORF 916 bp yang mengkode 291 asam amino dengan massa molekul teoritis 35 kDa. Enzim rekombinan T. lanuginosus memiliki suhu optimum 80 C dan pH optimum 8.

---

Lipase is one of the most important industrial enzymes, which is widely used in the preparation of food additives, cosmetics, and pharmaceutical industries. In the previous study, we have cloned synthetic Thermomyces lanuginosus lipase gene into Bacillus subtilis and Escherichia coli and resulting low expression of enzyme activity.

The aim of this research was to construct the T. lanuginosus lipase TLL gene into P. pastoris vector expression with TLL original signal peptide. Thermomyces lanuginosus lipase gene was amplified by PCR and contained original signal peptide and then inserted into pPICZ A between XhoI and XbaI site, and transformed into competent cell E. coli DH5. From the transformant, two of positive recombinants were analyzed by sequencing analysis.

As the result, both of two recombinant have a positive target gene which has lipase gene. The correct plasmid was linearized and then was transformed into P. pastoris X 33 by electroporation method. Thermomyces lanuginosus synthetic gene lipase has been successfully integrated into chromosome of P. pastoris X 33, which revealed by clear zones around the colony on Yeast extract Peptone Dextrose Tributyrin YPD.TB plate with zeocin.

The Thermomyces lanuginosus lipase had an open reading frame of 916 bp encoding TLL of 291 amino acids with theoretical molecular mass of 35 kDa. The recombinant enzyme, T. lanuginosus lipase had optimal temperature at 80 C and optimal pH at pH 8.0."

"Lipase EC 3.1.1.3 merupakan enzim hidrolase yang berpotensi dalam berbagai aplikasi di bidang bioteknologi dan industri. Pada penelitian di Pusat Teknologi Bioindustri, LAPTIAB-BPPT, gen sintetik lipase Rhizomucor miehei RMlip telah diklona menggunakan vektor pUC57 ke dalam Escherichia coli DH5?, pengekspresian enzim lipase masih dihasilkan secara intraseluler. Penelitian ini bertujuan melakukan subklona gen RMlip dengan peptida sinyal alaminya ke dalam vektor ekspresi Pichia pastoris dan mengkarakterisasi produk gennya. Gen RMlip dengan peptida sinyal alami diperoleh dengan PCR, dipotong dengan XhoI dan XbaI, kemudian diligasi ke dalam pPICZ? A yang telah dilinearisasi dengan enzim yang sama. Kontruksi plasmid rekombinan tersebut dianalisis dengan enzim restriksi dan pengurutan DNA. Plasmid rekombinan dengan urutan DNA yang tepat kemudian ditransformasikan ke P. pastoris X33. Transforman yang tahan terhadap zeocin dan menghasilkan zona bening dianalisis dengan PCR koloni dan enzim restriksi. Transforman yang mengandung RMlip digunakan untuk produksi lipase. Kultivasi dilakukan dengan penambahan 1,5 metanol setiap hari dengan aerasi yang sesuai. Perkiraan berat molekul dilakukan dengan metode SDS-PAGE. Karakterisasi enzim dilakukan terhadap suhu dan pH. Rentang suhu yang diujikan yaitu 30 m-80oC, sedangkan variasi pH yaitu 5 m-10. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen RMlip sebesar 1.132 pb berhasil disubklona ke pPICZ? A, sehingga diperoleh total ukuran DNA sebesar 4.629 pb. Lipase rekombinan yang diproduksi oleh P. pastoris X33 yang mengandung gen RMlip di dalam kromosonnya, mempunyai berat molekul sebesar 32,9 kDa. Aktivitas enzim lipasenya memiliki suhu dan pH optimum pada suhu 30oC dan pH 9. Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa gen RMlip yang mengandung peptida sinyal alami dapat disubklona dan diekspresikan pada P. pastoris X33 dan lipase yang diekspresikan secara ekstraseluler memiliki karakter tertentu.

---

Lipases EC 3.1.1.3 are a hydrolases enzyme that potential in many applications in the field of biotechnology and industrial. In the studies at the Center of Bioindustrial Technology, LAPTIAB BPPT, the synthetic Rhizomucor miehei lipase gene RMlip have been cloned using the vector pUC57 in Escherichia coli DH5 , the expression of lipase was produced intracellularly.

This study aims to subcloning RMlip gene with the original signal peptide into Pichia pastoris expression vector and characterize gene products. The RMlip gene with the original signal peptide had been obtained by PCR, cut by XhoI and XbaI and then ligated into pPICZ A linearized with the same enzymes. The construction of the recombinant plasmid was analyzed by DNA sequenced. The recombinant plasmid with the correct DNA sequence was transformed into P. pastoris X33. Zeocin resistant transformants and form a clear zone around colonies were analyzed by colony PCR and restriction enzymes analyses.

Transformants that containing RMlip is used for the production of lipase. Cultivation of recombinant P. pastoris was carried out with the addition of 1.5 methanol every day with appropriate aeration. Estimated molecular weight was carried out by using SDS PAGE. Enzyme characterization focused on the effect of temperature and pH. Variations in temperature tested were 30 mdash 80oC, while the pH variations pH 5.0 mdash 10.0.

As the result, a RMlip gene with the size of 1.132 bp was successfully subcloned to pPICZ A, thus obtained the total size of DNA is 4.629 bp. The recombinant lipase produced by P. pastoris X33 containing RMlip in its chromosomal DNA, had a molecular weight of 32.9 kDa. Lipase activity had an optimal temperature and pH 30oC and 9.0, respectively.

It can be concluded that, RMlip gene containing the original signal peptide can be subcloned and expressed into P. pastoris X33 and the lipase expressed extracellularly has a certain character."