Protein Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) memiliki peran spesifik dalam menstimulasi poliferasi dan pematangan sel neutrofil. Penelitian sebelumnya, gen CSF3 telah berhasil dikontruksi secara in vitro di dalam vektor pPICZα dengan penyisipan kodon metionin pada ujung-5’ dan kodon stop pada ujung-3’ dari gen CSF3. Kontruksi tersebut menghasilkan pPICZα-metCSF3. Tujuan penelitian ini adalah transformasi plasmid pPICZα-metCSF3 pada sel inang Komagataella phaffii dan melakukan pengujian fenotipe Mut pada sel transforman yang diperoleh. Plasmid pPICZα-metCSF3 diisolasi dari Escherichia coli DH5α dan dilinierisasi sehingga menghasilkan plasmid linier berukuran 4.131 pb. Plasmid rekombinan dipurifikasi dan dikuantifikasi, selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel inang K. phaffii dengan metode elektroporasi. Jumlah koloni yang terbentuk berkisar 214 koloni transforman dan nilai efisiesi transformasi mencapai 0,18 x 103 cfu/µg plasmid DNA. Seleksi koloni transforman dilakukan pada medium YPD dengan konsentrasi zeosin yang bertingkat. Sebanyak 15 dari 23 koloni transfoman memiliki resistensi terhadap seluruh tingkatan konsentrasi zeosin. Pengujian fenotipe Mut pada 23 koloni transforman memiliki fenotipe Mut+. Berdasarkan data pengamatan yang diperoleh bahwa K. phaffii berhasil membawa plasmid pPICZα-metCSF3 dan koloni transforman memiliki keberadaan gen aktif AOX1 dan AOX2 (fenotipe Mut+).
Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF) protein has a specific role to stimulate proliferation and maturation of neutrophils. Previous research has succeeded an in vitro construction of CSF3 gene on pPICZα vector, while inserting a methionine codon at 5’-end and two stop codons at 3’-end of CSF3 gene sequences. The metCSF3 gene has been formed in recombinant plasmid named pPICZα-metCSF3. The purposes of this research are to transform the pPICZα-metCSF3 recombinant plasmid into Komagataella phaffii host and conducting the phenotype Mut analysis on the transformant colonies. The pPICZα-metCSF3 plasmid was isolated from Escherichia coli DH5α and was linearized to 4.131 bp of plasmid in size. pPICZα-metCSF3 plasmid was purified and quantified, then it was transformed into K. phaffii through electroporation method. Approximately 214 transformant colonies successfully produced and the transformation efficiency reached up to 0,18 x 103 cfu/µg of DNA plasmid. The transformant was selected on YPD medium with increasing zeocin concentration. Approximately 15 out of 23 transformant were resistant against all stage of zeocin concentration. The determination of Mut phenotype on 23 transformant colonies categorized as Mut+ phenotype. In brief, K. phaffii has been succeded to bring pPICZα-metCSF3 plasmid and transformant colonies have active AOX1 and AOX2 gene (Mut+ phenotype).
Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) telah ditemukan sebagai protein reseptor spesifik pada beberapa jenis sel kanker. Protein tersebut merupakan hasil ekspresi dari salah satu jenis mutan gen EGFR, yaitu gen EGFRvIII. Mutasi pada gen EGFRvIII terjadi karena adanya delesi ekson 2 hingga 7 yang merupakan bagian dari domain ekstraselular yang berinteraksi dengan ligan alaminya. Keberadaan EGFRvIII yang spesifik hanya pada sel kanker memberikan potensi bagi protein tersebut untuk dijadikan sebagai molekul target pada terapi penargetan kanker dengan antibodi monoklonal. Fragmen antibodi untai tunggal (ScFv) anti-EGFRvIII merupakan antibodi monoklonal yang dapat digunakan sebagai ligan spesifik terhadap EGFRvIII dalam simulasi terapi penargetan kanker. Antibodi ScFv-anti-EGFRvIII dapat diproduksi menggunakan plasmid pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp. Plasmid rekombinan ini memiliki promotor indusibel AOX1 dan sinyal sekresi matting factor-a yang dapat ditransformasikan pada Komagataella phaffii sehingga antibodi ScFv-anti-EGFRvIII dapat disekresikan oleh sel inang. Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan klona K. phaffii transforman yang membawa gen ScFv-anti-EGFRvIII. Plasmid diisolasi dari Escherichia coli TOP10F` dan dipurifikasi dengan pelarut organik. Plasmid kemudian dipotong dengan enzim SacI sehingga diperoleh plasmid linear yang berukuran 5.150 bp. Metode transformasi yang digunakan adalah elektroporasi. Seleksi K. phaffii transforman dilakukan pada medium seleksi yang mengandung antibiotik zeocin. Hasil penelitian menunjukkan klona K. phaffii transforman yang mengandung plasmid rekombinan pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp (5150 bp) berhasil diperoleh. Hasil seleksi K. phaffii transforman dengan replica platting menunjukkan, bahwa seluruh koloni tunggal transforman yang terpilih dapat tumbuh dengan baik pada konsentrasi zeocin 100 μg/mL. Hal tersebut mengindikasikan, bahwa plasmid rekombinan pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp dapat berintegrasi ke dalam genom K. phaffii secara stabil.
Cancer is a disease caused by abnormal proliferation of cell which can produce fatal effects for an organ system. Epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII) has been found to be a spesific receptor protein in several tyoes of cancer cells. The protein is expressed by one of many types of mutant from EGFR gene, namely EGFRvIII. Mutation in EGFRvIII gene occur because of deletion on exon 2 to exon 7 that are part of the extracellular domain that interacts with their natural ligand. The specificity of EGFRvIII on cancer cells EGFRvIII provides a potential for the protein to be used as target molecule in cancer-targeting therapy with monoclonal antibodies. Single-chain variable fragment (ScFv) of anti-EGFRvIII is a monoclonal antibody that can be used as specific ligands against EGFRvIII in simulating cancer-targeting theraphy. The ScFv-anti-EGFRvIII antibody can be produced using the pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp plasmid. This recombinant plasmid has an inducible AOX1 promoter and matting factor-a secretion signal that can be transformed into Komagataella phaffii so that the ScFv-anti-EGFRvIII antibody can be expressed extracellularly. The purpose of this study is to obtain a K. phaffii transformant clone that carries the ScFv-anti-EGFRvIII gene. The plasmid were isolated from Escherichia coli TOP10F` and purified. Plasmid were then cut with the SacI enzym so that a 5.150 bp linear plasmid was obtained. The method of transformation in this study is electroporation. The selection of K. phaffii transformant was carried out on a selection medium containing zeocin antibiotic. The results showed that K. phaffii transformant clone containing pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp (5150 bp) recombinant plasmid was succesfully obtained. The selection of K. phaffii transforman with replica platting shows that all selected single colony transformants can grow well at zeocin concentration of 100 μg/mL. The result indicate that the pPICZα-ScFv-anti-EGFRvIII-egfp recombinant plasmid can be integrated into K. phaffii genome stably.
