Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Produksi enzim CRISPR-Cas9 dan dCas9 rekombinan di Indonesia saat ini masih bergantung pada metode induksi Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) konvensional yang memiliki keterbatasan biaya dan efisiensi. Metode autoinduksi belum pernah dieksplorasi untuk produksi kedua enzim ini, padahal berpotensi menjadi alternatif yang lebih ekonomis dan mendukung kemandirian teknologi bioteknologi lokal. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi efektivitas metode autoinduksi untuk produksi enzim Cas9 dan dCas9 rekombinan sebagai alternatif metode induksi IPTG konvensional. Produksi enzim dilakukan menggunakan Escherichia coli BL21 (DE3) dengan plasmid pET-15b pada medium autoinduksi IC (Imperial College) dan LB (Luria Bertani) autoinduksi. Ekspresi protein dianalisis menggunakan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan dikuantifikasi dengan spektrofotometer pada berbagai waktu inkubasi. Pola pertumbuhan kultur menunjukkan ekspresi protein optimal terjadi saat transisi metabolisme dari glukosa ke laktosa pada akhir fase logaritmik, yaitu pada jam ke-6 menuju jam ke-9. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode autoinduksi berhasil mengekspresikan kedua enzim dengan kondisi optimal pada jam ke-9, dimana Cas9 mencapai konsentrasi 3,65 µg/mL pada medium LB dan dCas9 mencapai 1,21 µg/mL pada medium IC. Perbandingan dengan metode IPTG menunjukkan autoinduksi menghasilkan yield Cas9 yang lebih tinggi (3,65 vs 1,706 µg/mL) dengan hasil dCas9 yang cukup kompetitif (1,21 vs 1,558 µg/mL). Metode autoinduksi terbukti efektif sebagai alternatif ekonomis untuk produksi enzim CRISPR rekombinan tanpa memerlukan induktor eksternal.

---

The production of recombinant CRISPR-Cas9 and dCas9 enzymes in Indonesia currently relies on the conventional Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction method, which has limitations in terms of cost and efficiency. The autoinduction method has not been explored for the production of these two enzymes, even though it has the potential to be a more economical alternative and support the independence of local biotechnology. This study aims to evaluate the effectiveness of the autoinduction method for the production of recombinant Cas9 and dCas9 enzymes as an alternative to the conventional IPTG induction method. Enzyme production was carried out using Escherichia coli BL21 (DE3) with the pET-15b plasmid on autoinduction IC and LB media. Protein expression was analyzed using Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and quantified with a spectrophotometer at various incubation times. The culture growth pattern showed that optimal protein expression occurred during the metabolic transition from glucose to lactose at the end of the logarithmic phase, from the 6th hour to the 9th hour. The results showed that the autoinduction method successfully expressed both enzymes with optimal conditions at the 9th hour, where Cas9 reached a concentration of 3.65 µg/mL in LB medium and dCas9 reached 1.21 µg/mL in IC medium. Comparison with the IPTG method showed that autoinduction resulted in a higher Cas9 yield (3.65 vs 1.706 µg/mL) with a fairly competitive dCas9 yield (1.21 vs 1.558 µg/mL). The autoinduction method proved to be effective as an economical alternative for the production of recombinant CRISPR enzymes without the need for an external inductor."

"Protein rekombinan yang difusikan ke suatu peptida tag dapat dimobilisasi pada matriks yang telah dilapisi substrat berafinitas dengan tag tersebut. Dalam proses purifikasi, protein tag kadang kala dipisahkan dari protein rekombinan. Pemisahan tag dapat dilakukan dengar menyisipkan sekuens pengenalan protease di antara tag dan protein rekombinan yang memungkinkan pemisahan tag dari protein rekombinan oleh restriksi enzim protease. Pada beberapa sistem purifikasi, protease yang telah difusikan dengan tag telah digunakan untuk memotong peptida tag, sehingga baik tag maupun protease yang memotong tag dari protein dapat dipisahkan dari protein rekombinan. Sistem tersebut sangat menguntungkan namun hanya protease PreScission (protease Human Rhinovirus) yang telah dikembangkan untuk sistem tersebut. Oleh karena itu, untuk memperoleh alternalif lain dari sistem tersebut. dilakukan konstruksi vektor pengekspresi protease MLV di dalam sistem ekspresi protein fusi tag GST. Gen protease MLV disisipkan di antara situs restriksi BamHI dan EcoRl pGEX-6P-1, di hilir ORF GST dan situs pengenalan protease PreScission. Penyisipan gen protease MLV di dalam plasmid rekombinan (pG6PI.Pro) dikonfirmasi dengan analisis perbandingan pola migrasi pG6P1.Pro yang dibandingkan dengan plasmid wild type (pGEX-6P-1) dan identifikasi insert pada jel agarose setelah restriksi dengan BamHI-EcoRI. Konfirmasi orientasi gen protease dalam pG6P1.Pro dengan analisis restriksi enzim Apal, dan Bs:Ell. Konfirmasi akhir yang bersifat definitif dilakukan dengan sekuensing pG6PI.Pro. Hasil analisis tersebut menunjukkan bahwa pG6P 1.Pro telah berhasil dikonstruksi dengan benar. namun dari hasil ekspresi protein fusi GST-Protease MLV tidak mendapatkan protein fusi utuh (43,8 kDa). Mutasi pada N terminal protease tidak mempengaruhi ekspresi protein fusi GST-Protease MLV dan tetap tidak menghasilkan protein fusi yang utuh (44,8 kDa dan 43,97 1:Da). Kegagalan ekspresi protein fusi tersebut mungkin disebabkan adanya peristiwa autokatalisis."

"Gen pol murine leukemia virus adalah gen pengkode enzim reverse transcriptase (RT) yang berfungsi untuk mentranskripsi balik genom RNA virus menjadi DNA. Enzim RT banyak digunakan sebagai komponen dalam RT-PCR untuk mensintesis cDNA dari RNA. Penelitian bertujuan mengekspresikan gen pol MLV dan mengetahui fungsi enzim RT yang dihasilkan. Gen pol MLV dalam penelitian sebelumnya, telah dikonstruksi tidak memiliki sekuen pengkode asam amino RNase H dan berhasil ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21. Eskpresi gen pol dilakukan menggunakan induksi IPTG 0,3 mM. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen pol MLV telah berhasil diekspresikan dan menghasilkan enzim RT tanpa RNase H dengan berat molekul ~58 kDa. Enzim RT selanjutnya dipurifikasi menggunakan resin Ni-NTA dan dilakukan pengujian fungsi enzim tersebut dengan RT-PCR. Hasil analisis menunjukkan bahwa enzim RT dalam penelitian terbukti dapat berfungsi mensintesis cDNA menggunakan cetakan RNA pada proses RT-PCR."

"ABSTRAKSalah satu permasalahan yang dihadapi oleh pengobatan regeneratif menggunakan sel punca adalah metode verifikasi sifat pluripotensi terhadap sel punca yang telah diperoleh. Verifikasi sifat pluripotensi dilakukan dengan menggunakan antibodi untuk mengenali protein marka sel punca yang dihasilkan oleh sel tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan dan mempurifikasi salah satu protein marka sel punca, yaitu SOX2 sehingga dapat digunakan untuk memproduksi antibodi yang dapat digunakan untuk proses verifikasi tersebut. Ekspresi protein SOX2 dilakukan pada sistem ekspresi Escherichia coli BL21 codon plus dengan menggunakan plasmid rekombinan pQE-80L Sox2, kemudian protein SOX2 diverifikasi secara kualitatif dengan menggunakan SDS-PAGE dan Western blot. Hasil menunjukkan bahwa SOX2 telah berhasil diekspresikan pada sistem ekspresi yang digunakan, namun kodon gen sintetik Sox2 yang belum teroptimasi untuk beradaptasi pada sistem ekspresi menyebabkan jumlah protein yang dihasilkan sedikit. Purifikasi SOX2 juga telah berhasil dilakukan dengan menggunakan sistem purifikasi Ni-NTA dalam keadaan terdenaturasi.

---

ABSTRACTOne of the problems faced by the use of stem cells in regenerative medicine is to find a proper method for verifying the pluripotency of a stem cell obtained. Verification of the cell pluripotency can be accomplished by using an antibody to identify the stem cell protein marker produced by the cell. The purpose of this research is to express and purify one of the stem cell marker protein, SOX2, in order to produce the antibody that can be used in the verification process. SOX2 protein expression was acomplished by using Escherichia coli BL21 codon plus expression system as host with pQE 80L Sox2 recombinant plasmid. The protein SOX2 obtained then was qualitatively verified by using SDS PAGE and Western blotting. Result showed that SOX2 has been successfully expressed by the expression system used. However, the unoptimized codon of the synthetic Sox2 gene causing the codon unable to adapt properly to the expression system, therefore may affect the translation process and lower the protein yield. Purification of SOX2 protein was also has been successfully conducted by using Ni NTA purification system in denatured protein condition."

"Penyakit Jembrana adalah penyakit viral akut yang hanya menyerang sapi Bali (Bos sondaicus). Jembrana Transmembrane (JTM) merupakan salah satu protein viral yang dapat digunakan sebagai bahan pembuatan vaksin Jembrana. Penelitian bertujuan untuk mendapatkan nilai optimum kepadatan sel Escherichia coli BL21 terhadap ekspresi protein rekombinan JTM pGEX. Re-transformasi dilakukan untuk mendapatkan transforman baru yang memiliki plasmid yang masih aktif. Hasil re-transformasi diperoleh dua koloni transforman. Ekspresi protein rekombinan JTM-pGEX dilakukan dengan menggunakan induksi IPTG 100 mM pada nilai OD600 0,4; 0,6; dan 0,8. Hasil penelitian menunjukkan ekspresi protein rekombinan JTM-pGEX paling tinggi didapatkan pada nilai OD600 = 0,6 (hasil refolding) dan OD600 = 0,4 (hasil solubilisasi).

---

Jembrana disease is an acute viral disease in Bali cattle (Bos sondaicus). Jembrana Transmembrane (JTM) is one of viral protein which can be utilized as a material for Jembrana vaccine. The aim of the research was to determine the best value of Escherichia coli BL21 optical density in order to get optimal expression of recombinant protein JTM-pGEX. Re-transformasion was conducted to get new transformant which have an active DNA plasmid. The result showed two transformant colonies of Escherichia coli BL21. Expression of recombinant protein JTM-pGEX was carried out using induction IPTG 100 mM in OD600 0.4; 0.6; and 0.8. The result revealed that the best value of OD600=0.6 produced the highest expression of recombinant protein JTM-pGEX after refolding while OD600 0.4 produced the highest expression of recombinant protein JTM-pGEX after solubilization."