Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Virus Influenza A H5N1 sampai saat ini masih menjadi masalah kesehatan yang signifikan. Kemampuan genetic drift dan shift virus dapat menjadi ancaman bagi efikasi vaksin influenza A H5N1 yang ada saat ini. Pengembangan vaksin influenza berbasis respon sel T CD8 diharapkan dapat memberikan daya proteksi silang yang lebih luas. FATTC-CTL assay merupakan suatu metode pengukuran aktivitas sel sitotoksik sel T CD8 melalui kuantifikasi lisis sel target pengekspresi antigen dan protein penanda oleh sel T CD8. Tahapan awal untuk pembuatan FATTC-CTL assay adalah konstruksi plasmid penyandi mRNA bisistronik. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi plasmid penyandi mRNA bisistronik pengekspresi protein Hemaglutinin (HA) dari H5N1 dan protein penanda enhanced Green Fluorescent (eGFP) melalui sistem internal ribosome entry site (IRES). Gen eGFP, HA H5N1, dan elemen IRES HIV-1 diklona ke dalam vektor ekspresi mamalia pcDNA5FRT/TO. Konstruksi plasmid rekombinan penyandi mRNA bisistronik tersebut kemudian ditransfeksi transien ke dalam sel CHO-K1. Analisis ekspresi dari plasmid bisistronik dilakukan dengan pengamatan hasil pewarnaan imunofluoresens menggunakan mikroskop konfokal. Kuantifikasi ekspresi sel pengekspresi eGFP diketahui menggunakan perangkat TALI cytometer. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen Hemaglutinin (HA) H5N1, sekuen IRES HIV-1, dan eGFP berhasil diklona ke dalam vektor plasmid pcDNA5FRT/TO. Pengujian transfeksi transien terhadap seluruh klona plasmid, yaitu plasmid wild type pcDNA5FRT/TO, pcDNA5FRT/TO-eGFP, pcDNA5FRT/TO-IRESHIV1-GFP, pcDNA5FRT/TO-HA H5N1 dan pcDNA5FRT/TO-HA H5N1-IRESHIV1-GFP ke dalam sel CHO-K1 menunjukkan bahwa protein Hemaglutinin dan eGFP berhasil diekspresikan. Perbandingan rerata sel CHO-K1 pengekspresi eGFP dari sel setelah ditransfeksi dengan setiap konstruksi plasmid tersebut di atas menunjukkan bahwa ekspresi eGFP pada sel CHO-K1 ditransfeksi plasmid rekombinan pengekspresi mRNA bisistronik HA dan eGFP relatif lebih rendah dibandingkan yang ditransfeksi plasmid rekombinan pengekspresi mRNA monosistronik eGFP maupun plasmid rekombinan pengekspresi mRNA bisistronik yang mengandung gen penyandi eGFP dan IRES HIV-1. ...... H5N1 Influenza A infection remains a significant human and animal health problem in the worldwide. The continuous antigenic drift and shift of virus can become threatens the efficacy of the influenza vaccines nowadays. Development of CD8 T cells response based influenza vaccine is expected to provide the broader cross protection. Fluorescent Antigen-Transfected Target Cell-CTL (FATT-CTL) assay is currently developing method to measure the activities of CD8 cytotoxic T cells. The aim of this study is to construct and transiently expressing the bicistronic vector carried H5N1 hemagglutinin (HA H5N1) and enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene, linked with internal ribosome entry site element of HIV-1. The eGFP, HA H5N1, and IRES HIV-1 gene were cloned into pcDNA5FR/TO plasmid. The recombinant plasmid encoding bicistronic mRNA was transiently transfected into CHO-K1 cell. Analysis of the bicistronic plasmid expression were done by indirect immunofluorescence and visualized with confocal microscope. Quantification of cells expressing eGFP protein were done by using TALI cytometer. The nucleotide sequencing result showed that the open reading frame of the Hemaglutinin (HA) H5N1–IRES HIV-eGFP DNA was accurately cloned into pcDNA5FRT/TO. Transient transfection of all the plasmid constructs (wild type pcDNA5FRT/TO, pcDNA5FRT/TO-eGFP, pcDNA5FRT/TO-IRESHIV1-GFP, pcDNA5FRT/TO-HA H5N1 and pcDNA5FRT/TO-HA H5N1-IRESHIV1-GFP) show that hemagglutinin and enhanced green fluorescent protein successfully expressed in CHO-K1 cells. Comparison of mean CHO-K1 cells expresssing eGFP from cells after transfected with each plasmid construction above shows that EGFP expression in CHO-K1 cells transfected recombinant plasmids expressing HA and eGFP bicistronic mRNA relatively lower than those transfected recombinant plasmid expressing EGFP mRNA monocistronic and recombinant plasmid expressing bicistronic mRNA containing EGFP-coding genes and IRES HIV-1.

Abstrak :
Indonesia is one country with highest number cases of H5N1 influenza virus infection. Therefore, it is necessary to attempt to overcome the infection and prevent a pandemic. Vaccines are one of the effective efforts for the prevention of infectious diseases. This study will be developed H5N1 virus-like particle (VLP) vaccine detection system with green fluorescent protein (GFP). H5N1 VLP and GFP protein encoding plasmid was constructed in a transient pBACgus4x-1 which has four promoters of baculovirus expression, two polh promoters and two p10 promoters. Construction of plasmid transient conducted gradually. Each H5N1 VLP protein (HA, NA, and M) encoding gene and the eGFP gene was inserted in a different promoter. Based on analysis of polymerase chain reaction (PCR), restriction enzymes and sequencing, the recombinant plasmid construction pBACM1H5N1eGFP successfully obtained. Co-transfection of pBACM1H5N1eGFP with BacVector® 1000 showed GFP successfully expressed. GFP expressed continuously from co-transfection until 5th passage and used as a parameter of recombinant baculovirus infection and VLP encoding protein expression. Until the passage of the 5th, the highest percentage of expression is 3%. PCR results have confirmed the presence of VLP and GFP gene in Sf9 cells infected with recombinant baculovirus. Results of immunostaining using polyclonal antibodies against HA, NA and M are observed in confocal microscopy have shown the presence of H5N1-forming protein expression is at GFP expressing cells. GFP detection system to control the H5N1 VLP expression has been successfully performed. The increase of titer recombinant baculovirus in Sf9 cells is required to detect recombinant baculovirus and VLP.

---

Indonesia merupakan salah satu negara dengan kasus infeksi virus influenza H5N1 terbanyak dibandingkan negara lainnya. Oleh karena itu perlu dilakukan usaha untuk menanggulangi infeksi dan mencegah terjadinya pandemi. Vaksin merupakan salah satu upaya yang efektif untuk pencegahan penyakit infeksi. Dalam penelitian ini akan dikembangkan vaksin virus-like particle (VLP) H5N1 dengan sistem pendeteksi green fluorescent protein (GFP). Protein pengkode VLP H5N1 dan GFP dikonstruksi dalam satu plasmid transien pBACgus4x-1 yang memiliki empat promotor ekspresi baculovirus yaitu dua promotor polh dan dua promotor p10. Konstruksi plasmid transien dilakukan secara bertahap. Setiap gen pengkode VLP H5N1 (HA, NA, dan M) serta gen eGFP diinsersi di promotor yang berbeda. Berdasarkan hasil analisis polymerase chain reaction (PCR), enzim restriksi dan sekuensing, konstruksi plasmid rekombinan pBACM1H5N1eGFP berhasil diperoleh. Kotransfeksi pBACM1H5N1eGFP dengan BacVector® 1000 memperlihatkan GFP berhasil diekspresi. Protein GFP berhasil diekspresi secara kontinu dari tahap ko-transfeksi hingga pasase ke-5 dan dijadikan sebagai parameter infeksi baculovirus rekombinan dan ekspresi protein pembentuk VLP. Hingga pasase ke-5, persentase ekspresi paling tinggi hanya 3%. Hasil PCR telah mengkonfirmasi adanya gen penyandi VLP dan GFP di sel SF9 yang terinfeksi baculovirus rekombinan. Hasil immunostaining menggunakan antibodi poliklonal terhadap HA, NA dan M yang diamati pada mikroskop konfokal telah menunjukkan adanya ekspresi protein pembentuk H5N1 yang berada pada sel pengekspresi GFP. Sistem pendeteksi GFP untuk kontrol ekspresi VLP H5N1 telah berhasil dilakukan. Peningkatan titer baculovirus rekombinan pada sel SF9 diperlukan untuk mendeteksi Baculovirus rekombinan dan VLP.