ABSTRAK
Enzim lipase EC 3.1.1.3, triasilgliserol asilhidrolase merupakan kelompok enzim yang menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Selain itu, enzim lipase berperan dalam berbagai rekasi, seperti reaksi esterifikasi, interesterifikasi, dan transesterifikasi. Penelitian ini bertujuan melakukan subkloning gen lipase Bacilus subtilis dari vektor pGEMlipA ke dalam vektor pSKE xyn AQ1 dengan metode Exponential Megapriming PCR EMP dan transformasi vektor pSKExynlipA rekombinan ke Bacilus subtilis DB104. Megaprimer yang digunakan untuk EMP disintesa melalui reaksi PCR menggungakan primer spesifik gen lipase yang didesain berdasarkan deret nukleotida gen lipA dan xynAQ1 sedemikian rupa sehingga merupakan gabungan deret nukleotida kedua gen tersebut, dengan vektor pGEMlipA sebagai template DNA. Produk PCR yang dihasilkan berukuran 792 pb selanjutnya digunakan sebagai megaprimer untuk EMP dengan vektor pSKExynAq1 sebagai template DNA. Produk EMP yang dihasilkan pSKExynlipA kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli DH5 ? ? . Tahap selanjutnya vektor diekstraksi dari E. coli untuk ditransformasikan ke dalam B. subtilis DB104 dengan metode protoplasting dilanjutkan dengan tahap integrasi gen lipA ke dalam kromosom B. subtilis DB104. Kloning gen lipase ke dalam vektor pSKExynAq1 dengan metode EMP telah berhasil dengan diperolehnya pita berukuran sesuai harapan, yaitu 7849 pb. Produk EMP tersebut berhasil mentransformasi E. coli DH5 ? ? yang tumbuh pada media LB yang mengandung ampisilin. Seleksi kualitatif klona positiF menggunakan media agar mengandung asam tri butirat TBA, tri-butyric acid berhasil mendapatkan 1 klona klon 1 yang menghasilkan zona bening. Plasmid rekombinan yang diisolasi dari klon 1 tersebut berhasil ditransformasikan ke dalam B. subtilis DB104 pada media DM3 mengandung eritromisin. Analisis menggunakan enzim restriksi PstI terhadap plasmid pSKExynlipA yang diekstraksi dari beberapa transforman B. subtilis diperoleh 1 koloni rekombinan positif yang mengandung DNA target. Eksperimen integrasi kromosom menghasilkan pertumbuhan koloni pada media LB dengan berbagai konsentrasi eritromisin yaitu LB tanpa eritromisin, LB eritromisin 0,5 g/ mL, dan LB eritromisin 5 g/ mL. Analisis terhadap klona integran positif dilakukan dengan PCR genom, namun hasil penelitian menunjukkan belum didapatkan klona positif dari 60 klona yang tumbuh pada media LB tanpa eritromisin.
ABSTRACT
Enzyme lipase EC 3.1.1.3, triasilglycerol acylhydrolase is a group of enzymes that hydrolyzed fat into fatty acids and glycerol. In addition, the lipase enzyme plays a role in various reactions, such as esterification, interesterification, and transesterification reactions. The present study was conducted to subclone the Baillus subtilis lipase gene lipA cloned in the pGEMlipA recombinant vector into pSKExynAQ1 recombinant vector by EMP method and to transform the resulted pSKExynlipA recombinant vector into Bacilus subtilis DB104. Megaprimer used in the EMP was synthesized by PCR using a pair of gen specific primer designed based on lipA and xynAq1 nucleotide sequencces so that the oligonucleotide is a comibantion of both nucleotide sequences, with pGEMlipA served as DNA template. The resulted PCR product was used as megaprimer for the EMP with the pSKExynAq1 recombinant vector served as DNA template. The resulted EMP product pSKExynlipA was used to transform E. coli DH5 . The recombinant vector was then extracted from E. coli to be transformed into B. subtilis DB104 by the method of protoplasting followed by integration of the lipase gen into the B. subtilis DB104 chromosome. EMP Cloning of the lipase gene into the pSKExynAQ1 vector has been successfuly conducted that resulted in specific band of 7849 bp. The EMP product was successfully transformed E. coli colonies grew on LB media containing ampicillin. Qualitiative selection of positive colonies using TBA tri butyric acid agar media resulted in 1 positive clone clone 1 that produed a clear zone. The recombinant plasmid has been successfully transformed into B. subtilis DB104 using protoplasting method. Analyzed recombinant with digestion using PstI restriction enzyme showed 1 colony as positive recombinant containing target DNA. The result of chromosome integration showed colonies growing on LB medium with various erythromycin concentrations, LB without erythromycin, LB erythromycin 0.5 g mL, and LB erythromycin 5 g mL. The isolat was analyzed with genomic PCR, and the results showed no positive isolates from 60 clones. |
T49873-Septi Anggraini Sugiarti .pdf :: Unduh