ABSTRAK
Glioblastoma multiforme adalah tumor otak ganas yang bersifat agresif dan invasif dengan tingkat kekambuhan yang tinggi. Pada lingkungan mikro tumor ditemukan berbagai sitokin dan kemokin yang disekresikan sel stroma yang memiliki peranan terhadap pertumbuhan, proliferasi sel, ketahanan hidup sel maupun apoptosis sel. Salah satu sitokin proinflamasi yang ditemukan pada conditioned medium sel punca tali pusat adalah TNF-a. Penelitian sebelumya pada sel glioblastoma multiforme yang diberikan conditioned medium sel punca tali pusat menunjukkan peningkatan ketahanan hidup sel, namun belum diketahui bagaimana pengaruh pensinyalan TNF-α pada ketahanan hidup sel tersebut. Dengan demikian tujuan penelitian ini untuk medeteksi TNF-a pada conditioned medium sel punca tali pusat dan menganalisis dampak pemberian conditioned medium terhadap ekspresi dan persinyalan TNF-a yang mempengaruhi ketahanan hidup sel glioblastoma multiforme. METODE: Dilakukan kultur sel glioblastoma T98G dengan DMEM komplit hingga subkonfluen. Kemudian sel punca tali pusat dikultur dengan medium aMEM komplit hingga subkonfluen. Setelah subkonfluen medium sel punca tali pusat diganti dengan medium aMEM tanpa serum untuk membuat conditioned medium (CM) dan diinkubasi selama 24 jam. Level TNF-a dianalisis dengan tehnik ELISA pada conditioned medium tersebut. CM dibuat dengan konsentrasi 50% (v/v) yang diberikan pada sel glioblstoma T98G. Setelah 24 jam, sel T98G diekstraksi untuk isolasi RNA dan protein. RNA total diperoleh dengan menggunakan reagen TriPure dan ekspresi mRNA TNFR1, TNFR2, TRAF2, dan NFκB dianalisis dengan qRT-PCR menggunakan reagen Sensifast SYBR NO ROX kit. Analisis ekspresi relatif menggunakan rumus Livak. Penghitungan kadar protein TNFR2 menggunakan metode sandwich ELISA. Ketahanan hidup sel yang dianalisis dengan menggunakan Trypan Blue. Analisa statistik menggunakan uji t independen dengan software SPSS 23. HASIL: TNF-α terdeteksi pada conditioned medium sebesar 4,4 pg/ml. Ekspresi relatif mRNA TNFR1 meningkat 1,4 kali (p=0,038), ekspresi realtif mRNA TNFR2 meningkat 4,9 kali (p=0,001), ekspresi relatif mRNA TRAF2 meningkat 5,5 kali (p=0,00), dan ekspresi relatif mRNA NFκB meningkat 1,8 kali (p=0,001) dari kontrol. Konsentrasi TNFR2 pada sel T98G yang diinduksi CM (11,2 pg/mg protein) meningkat 1,4 kali dibandingkan kontrol (7,7 pg/mg protein). Terdapat peningkatan proliferasi sel glioblastoma multiforme 1,7 kali pada sel T98G dengan pemberian CM dibandingkan dengan kontrol (p=0,002). KESIMPULAN: Conditioned medium sel punca tali pusat meningkatkan ekspresi pensinyalan TNF-α yang mempengaruhi ketahanan hidup sel GBM T98G.
ABSTRACT
Glioblastoma multiforme is a malignant primry brain tumorwhich is aggressive and invasive. Tumor microenvironment contained cytokinesand chemokines produced by MSCs stomal cells, could affect cell growth,proliferation, cell survival and apoptosis. One of the proinflammatory cytokinesfound in CM UCSCs is TNF a. On previous studies glioblastoma multiforme cellstreated conditioned medium umbilical cord mesenchymal stem cell showed highercell survival, but it was not known yet how the TNF a signaling affected theseproliferations. Thus the purpose of this study was to detect TNF-a in the conditionedmedium umbilical cord mesenchymal stem cell and to analyze the impact of theconditioned medium on the expression and cell survival of glioblastoma multiformecells through TNF-α signaling.METHODS: Gliolblastoma multiforme T98G cells were cultured with completeDMEM high glucose until subconfluence. Then umbilical cord derivedmesenchymal stem cells (UCSCs) were cultured on the αMEM medium completewith serum until subconfluence. Then UCSCs medium is replaced with the αMEMmedium to make conditioned medium for 24 hours. TNF α was detected in CMUCSC by ELISA. CM UCSCs concentration is 50% (v/v) to treat T98G cells. After24 hours, T98G cells was extracted for RNA and protein. RNA samples wereextracted using TriPure reagents and mRNA expressions TNFR1, TNFR2, TRAF2,and NFκB were calculated by qRT PCR with SYBR NO ROX kit. Analysis of relativeexpressions mRNA using the Livak formula. Protein levels TNFR2 was measuredusing sandwich ELISA. Cell survival was analyzed by Trypan Blue Exclucion Test.Statistics analysis using student t test and PASW 23.RESULT: TNF-α level detected in CM-UCSCs was 4,4 pg/ml. The relativeexpression of mRNA TNFR1 higher 1.4 fold (p=0.038), mRNA TNFR2 higher 4.9fold (p = 0.001), mRNA TRAF2 higher 5.5 fold (p=0,000), and mRNA NFκB higher1.8 fold (p=0,001) to control. Protein TNFR2 in CM treated cells (11.5 pg/mgprotein) was higher 1.4 fold to control (7.7 pg/mg protein). There was increase ofproliferation T98G cells higher 1,7 fold to control (p = 0.002).CONCLUSION: Conditioned medium umbilical cord derived mesenchymal stemcells (CM UCSCs) have increased the expression of TNF-α signaling for T98Gglioblastoma multiforme cell survival. |
T-Pdf Yohana.pdf :: Unduh