Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Keberhasilan produksi apoptin rekombinan dalam bentuk native pada penelitian sebelumnya (Khalid, 2012) membuka jalan untuk mengembangkan produksi protein antikanker ini ke skala yang lebih besar. Di dalam studi ini, dilakukan optimasi kultivasi bakteri rekombinan apoptin dalam stirred tank fermentor dan bakteri yang digunakan adalah bakteri Bacillus subtilis 168 rekombinan apoptin hasil transformasi dengan sistem Gateway menggunakan plasmid pOXGW12His8Arg. Parameter yang dioptimasi adalah konsentrasi induksi xylose, kecepatan agitasi dan laju aerasi. Variasi konsentrasi induksi xylose dilakukan dalam shake flasks dengan volume kultur 100 ml dengan konsentrasi 0-5% b/v sedangkan variasi kecepatan agitasi dan laju aerasi dilakukan dalam stirred tank fermentor dengan volume kultur 3L dengan kecepatan dan laju masing-masing adalah 150-250 rpm dan 0,5-1,5 NL/min. Hasil yang didapat adalah pertumbuhan bakteri optimum dicapai pada konsentrasi xylose 1% b/v, kecepatan agitasi 250 rpm, dan laju aerasi 1,5 NL/min dengan nilai laju pertumbuhan spesifik bakteri untuk masing-masing variasi adalah 0,628 h-1; 0,630 h-1; dan 0,747 h-1. ......The success of recombinan apoptin production in native form in the previous research (Khalid, 2012) open the way to develop this anticancer protein production to the larger scale. In this study, optimization of recombinant apoptin bacteria cultivation is carried out in a stirred tank fermentor using Bacillus subtilis 168 with plamid pOXGW12His8Arg which transformed by Gateway method. The optimized parameters are xylose-inducer concentration, agitation speed, and aeration rate. The xylose-inducer concentration variation is carried out in a shake flasks with 100 ml volume broth, while the agitation speed and aeration rate variation is carried out in a stirred tank fermentor with 3L volume broth. The xylose concentration is varied between 0-5% w/v, while agitation speed and aeration rate are varied between 150-250 rpm and 0,5-1,5 NL/min respectively. The best condition in this cultivation is 1% w/v of xylose, 250 rpm of agitation speed and 1,5 NL/min of aeration rate giving the specific growth rate value for each parameter of 0,628 h-1; 0,630 h-1; dan 0,747 h-1 respectively.

Abstrak :
ABSTRAK
Kanker adalah salah satu penyakit mematikan yang pengobatannya terus dikembangkan. Apoptin adalah molekul protein yang berpotensi untuk dijadikan obat kanker karena mempunyai aktivitas menginduksi proses kematian sel secara selektif hanya pada sel kanker saja. Kloning apoptin telah berhasil dilakukan dengan amplifkasi gen menggunakan PCR dengan menambahkan 12-histidin dan 8-arginin pada C-terminal kemudian diligase ke plasmid pOXGW dengan sistem Gateway, lalu diekspresikan ke dalam bakteri Bacillus subtilis 168. Plasmid pOXGW - apoptin - 12His8Arg dapat terekspresi di B. subtilis. Dalam penelitian ini Bacillus subtilis yang membawa plasmid diproduksi pada medium dengan variasi xylose sebagai substrat pemicu dan sebagai pembanding bakteri Escherichia coli Bl21 Star™ ditransformasi dengan plasmid pOGW - apoptin - 12His untuk kemudian dilakukan pemurnian. Hasil penelitian menunjukan apoptin rekombinan dari B. subtilis 168 yaitu 568 μg/ml, sedikit lebih banyak dari jumlah protein rekombinan E. coli Bl21 Star™, 421 μg/ml.

---

ABSTRACT
Cancer is a deadly disease so that the medicinal treatment constantly developed. Apoptin is a protein molecule that has potential to be used as a cancer drug because of its activity to induce cell death selectively to the cancer cells only. Cloning apoptin has been successfully performed by amplify gene using PCR with 12-histidine and 8-arginine to be added at C-terminal then ligated into plasmid pOXGW with Gateway system, and then expressed in Bacillus subtilis 168. Plasmids with pOXGW - apop - 12His8Arg can be expressed in B. subtilis. In this study, Bacillus subtilis carrying plasmid was produced with variations of xylose as substrate trigger on liquid medium and as a comparison, Escherichia coli Bl21 Star™ transformed with a plasmid pOGW - apop - 12His and then performed for purification of apoptin. The results showed that the recombinant apoptin obtain from B. subtilis 168 compared to Escherichia coli Bl21 Star is slightly higher, i.e. 568 μg/ml and 421 μg/ml, respectively.

Abstrak :
Menurut data statistik WHO, kanker merupakan salah satu penyebab kematian terbesar di dunia, dengan 8,2 juta kematian dari 14 juta kasus kanker terhitung di tahun 2012. Lebih spesifik untuk wilayah Asia Tenggara, WHO mencatat 1,72 juta kasus dengan 1,17 juta kematian. Apoptin banyak diteliti sebagai protein dengan potensi terapi kanker, karena memiliki kemampuan menginduksi apoptosis di sel kanker secara spesifik. Potensi apoptin mendorong penelitian untuk apoptin dengan kemampuan penetrasi baik dan produksi dalam skala lebih besar. Dalam penelitian ini, telah dilakukan modifikasi apoptin dari chicken anemia virus dengan menggunakan affinity tag (His)6 , tag (Arg)8 untuk peningkatan penetrasi dan (HlyA) untuk sekresi apoptin keluar dari sel inang Escherichia coli ke media pertumbuhan sel secara genetik. Penambahan affinity tag (His)6 memungkinkan apoptin dipurifikasi dalam 1 langkah menggunakan kolom kromatografi nikel. Pelepasan (His)6 dan HlyA tag dirancang untuk dilakukan dengan menggunakan situs proteolitik thrombin. Protein diekspresikan dalam sel Escherichia coli strain BL21 pLysS, dan BL21 CodonPlus pada suhu 37oC dan 28oC. Analisis dilakukan dengan SDS PAGE memberikan hasil bahwa protein terekspresi dengan ukuran antara 20-25 kDa. Konfirmasi protein dilakukan dengan purifikasi kromatografi afinitas Nikel. ...... Based on WHO statistica data, cancer is one of the deadliest disease in the world, with 8,2 millions of deaths out of 14 million of cases in 2012. More specifically in South East Asia, WHO data showed 1,72 million of cases with 1,17 million of deaths. Apoptin intensively studied for its potential as a therapeutic protein for cancer treatment, since it able to induce apoptosis in cancer cells specifically. The apoptin potential drives researcher to produce apoptin in larger scale. In this research, chicken anemia virus apoptin have been modified by adding (His)6 tag, (Arg)8 tag and HlyA tag for purification, penetration and secretion from Escherichia coli to the growth media proposed. The addition of (His)6 tag enable apoptin to be purified in 1 step using nickel chromatography column. Removal of (His)6 tag and HlyA tag designed using specific thrombin proteolytic site. Protein expressed in Escherichia coli strain BL21 pLysS, and BL21 CodonPlus in temperature of 37oC and 28oC. Analysis done by SDS PAGE shows that the protein expressed with size between 20-25 kDa. Further confirmation done by Nickel affinity chromatography.

Abstrak :
Kanker merupakan gangguan kesehatan yang menjadi sebuah masalah besar di dunia. Kanker adalah penyakit akibat pertumbuhan tidak normal dari sel-sel jaringan tubuh yang berubah menjadi sel kanker. Apoptin diketahui memiliki kemampuan untuk memicu apoptosis di sel kanker secara in vitro maupun in vivo, tetapi tidak pada sel normal. Apoptin merupakan protein dari Chicken Anemia Virus (CAV) yang pertama kali diperkenalkan di Jepang pada 1974. Produksi Apoptin dapat dilakukan pada inang Eschericia coli dengan memindahkan gen Apoptin melalui vektor plasmid pET9a. Gen Apoptin yang digunakan telah dimodifikasi untuk meningkatkan efisiensi dan kemudahan dalam proses purifikasinya dengan penambahan beberapa tag dan situs pemotongan Thrombin. Purifikasi dilakukan menggunakan kromatografi afinitas ion logam (IMAC) nikel. Apoptin termodifikasi dengan HlyA-tag, (His)6-tag, (Arg)8-tag dan situs proteolitik thrombin berhasil diekpsresikan dan dipurifikasi di dalam E.coli DH5α dan BL21 dengan analisis SDS-PAGE. Optimasi ekspresi dilakukan dengan variasi strain E. coli membuktikan BL21 Codon Plus merupakan inang paling baik, konsentrasi IPTG lebih optimal pada 1 mM dibandingkan 0.4 mM, dan pengaruh suhu antara 28o dan 37o tidak signifikan. Binding Buffer dan Elution Buffer, paling baik dilakukan dengan komposisi: 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, dan 40 mM (binding) / 500 mM (elution) imidazole, pada pH 7.4. ...... Cancer is a health problem that is becoming a big problem in the world. Cancer is a disease caused by abnormal growth of tissue cells of the body that turn into cancer cells. Apoptin known to have the ability to trigger apoptosis in cancer cells in vitro and in vivo, but not in normal cells. Apoptin is a protein of Chicken Anemia Virus (CAV), which was first introduced in Japan in 1974. The production of Apoptin can be performed on the host Escherichia coli with gene transfer vector plasmid pET9a. Apoptin gene used has been modified to improve the efficiency and ease of purification process with the addition of a few tags and Thrombin proteolytic site. Purification is done using ionic metal affinity chromatography (IMAC) nickel. Apoptin modified with HlyA-tag, (His)6-tag, (Arg)8-tag and thrombin proteolytic sites has been expressed and purified in E. coli DH5α and BL21 by SDS-PAGE analysis. Optimization conducted with several variation, expression in E. coli strain BL21 Codon Plus proved most optimum host, IPTG concentration at 1 mM given better expression than 0.4 mM, and the effect of temperature between 28o and 37o are insignificant. Binding buffer and the elution buffer, is best done with the composition: 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, and 40 mM (binding) or 500 mM (elution) imidazole in pH 7.4.

Abstrak :
To test the effect of one point mutation on the first initiation codon of Chicken Anemia Virus (CAV) open reading frame-3 (ORF-3), an apoptin knocked out expressor plasmid pCLS-VP3(-) and a CAV apoptin knocket out plasmid pCAV/Ap(-) were constructed. In both plasmids, the first ATG in ORF-3 was mutated into ACG by a reversed long PCR. No apoptin detected in COS-1 cells transfected with pCLS-VP3(-) using western blotting and immunofluorescence assay, while apoptin was detected in COS-1 cells transfected with pCLS wild type. After released from pCAV/Ap(-), the complete genome of CAV/Ap(-) was ligated to form the replicative form. The apoptin production was completely abolished in MDCC-MSB1 cells transpected with replicate form of CAV/Ap(-). The apoptin production was fully regained after a reverse mutation into CAV/Ap(-)RM. These data shows the first evidence that mutation of the first ATG of ORF-3 into ACG could completely abolish the production of apoptin.

Abstrak :
Protein apoptin dari virus anemia ayam telah diteliti memiliki potensi yang baik sebagai pendeteksi dini sel kanker. Keberhasilan produksi apoptin yang tidak lagi berupa badan inklusi telah memberikan harapan lebih besar untuk melakukan optimasi produksi protein apoptin rekombinan ini. Sel rekombinan apoptin yang berhasil diproduksi dalam skala besar dengan menggunakan inang Bacillus subtilis 168 pOXGW-apop-2His8Arg, pOGW-apop-12His dalam berbagai variasi kondisi kultivasi (konsentrasi substrat penginduksi, laju aerasi, dan laju agitasi) kemudian dipurifikasi menggunakan metode IMAC dalam kolom afinitas (HisTrap FF 5 mL) yang berisi ion logam transisi Ni2+ dengan menggunakan instrumen AKTA Prime Plus. Secara rata-rata, hasil purifikasi menunjukkan bahwa elusi apoptin rekombinan terjadi ketika nilai konduktivitas berada pada angka 15,85 mS/cm, dengan konsentrasi imidazole berada pada kisaran nilai 76% - 88% (384,8-442,4 mM), yang terlihat dari grafik gradien elusi. Pengukuran konsentrasi protein apoptin dengan menggunakan metode Bradford menujukkan bahwa konsentrasi terbesar diperoleh pada sampel dengan sistem agitasi 250 rpm dan laju aerasi 0,5 Nl/menit, dengan besar konsentrasi 0,0507 mg/ml. Hasil purifikasi berhasil dideteksi menggunakan SDS-PAGE 12% dengan hasil pita protein terlihat di area 15 kDa dan 58,5 kDa untuk semua sampel. ......Apoptin has been known to be having a great potency for cancer detection. The success of apoptin production which is not in inclusion body form anymore has given a bigger hope to optimize its production. Recombinant apoptin cells which was succesful to be cultivated in large scale using Bacillus subtilis 168 pOXGW-apop-12His8Arg, pOGW-apop-12His vector in various cultivation condition (aeration rate, agitation rate) then purified using IMAC method in Ni2+-loaded affinity column (HisTrap FF 5ml) and proceeded in AKTA Prime Plus instrument. Averagely, purifcation result showed that the elution of apoptin recombinant protein happened when the conductivity value at 15,85 mS/cm, with imidazole concentration lied around 76%-88% (384,8-442,4 mM), which could be seen from elusion gradient curve. The measurement of apoptin protein concentration using Bradford method showed that the biggest concentration was obtained from the sample with agitation rate 250 rpm and aeration rate 0,5 Nl/min, and the value is 0,0507 mg/ml. Purification yield was succesfully detected using SDS-PAGE 12%, with protein band was seen on 15 kDa and 58,5 kDa area for all samples.

Abstrak :
Apoptin merupakan protein dari virus anemia ayam yang dapat menginduksi apoptosis sel kanker. Penggunaannya sebagai senyawa antikanker dapat mengatasi kelemahan metode kemoterapi. Deteksi massa molekular apoptin dilakukan dengan SDS-PAGE memiliki keberagaman hasil dan asam-asam amino rekombinan dalam apoptin disinyalir menyadi penyebabnya. Karakterisasi asam-asam amino rekombinan dalam apoptin untuk membuktikan hipotesis tersebut dilakukan dengan dua variasi rekombinan plasmid, yakni modifikasi 12 histidin dan modifikasi 12 histidin-8 arginin yang ditransformasikan pada Escherichia coli DH5α. Kedua variasi modifikasi plasmid ini mendapatkan perlakuan yang sama. Transformasi plasmid dalam penelitian ini menggunakan metode heat shock dengan suhu 42oC dan bantuan CaCl2 dalam pembentukan sel Escherichia coli DH5α kompeten. Penentuan konsentrasi apoptin dilakukan dengan metode Lowry dan BSA sebagai protein standarnya. Deteksi massa molekular apoptin oleh metode SDS-PAGE dilakukan dengan konsentrasi gel sebesar 15% dan mendeteksi adanya pita protein di bawah 30 KDa. Uji karakterisasi asam amino yang dilakukan dengan Liquid Chromatography Mass Spectroscopy menunjukkan bahwa adanya konsentrasi asam amino berlebih dalam apoptin sehingga meningkatkan deteksi massa molekularnya oleh SDS-PAGE. ...... Apoptin is a protein from chicken anemia virus which could induce tumor cell apoptotic. The use of apoptin as anticancer could overwhelm chemotheraphy weaknesses. Apoptin molecular weight detection conducted by SDS-PAGE had various results while the recombinant amino acids are the suspects. Recombinant amino acids characterization of apoptin in order to prove the hypothesis was conducted by two variants of recombinant plasmid, which were 12 histidine modification dan 12 histidine-8 arginine modification, transformed into Escherichia coli DH5α. These two variations were given the same treatment. Heat shock method was used in plasmid transformation at 42oC and CaCl2 treatment was used in order to create Escherichia coli DH5α competent cells. Apoptin concentration determination was conducted by Lowry method and BSA was used as protein standard. Molecular weight detection of apoptin by SDS-PAGE was conducted using 15% gel concentration and there was protein band detected below 30 KDa. Amino acids characterization test conducted indicate that there are excess amino acids concentration in apoptin as the cause of increasing molecular weight detection by SDS-PAGE.